摘要
茶是一种天然无酒精饮料，其次生代谢产物中含有丰富的类黄酮、咖啡因和茶氨酸，这使得茶不仅品尝起来风味醇厚，还兼具提神和保健的效果，是最受欢迎的饮料之一。茶对健康的益处主要归因子儿茶素等茶中丰富的次生代谢产物，儿茶素是苯丙烷类和类黄酮生物合成途径的产物。非生物胁迫，如干旱、寒冷、高温、盐碱等，对全球农业生产造成相当大的损失。而且，这些常见的环境危害对茶叶特定化合物的代谢产生影响，严重威胁茶叶的产量和品质。植物通过体内复杂的分子调控来适应各种环境，其中涉及诱导应激反应和胁迫耐受性基因。转录因子是植物非生物胁迫反应的主要调控因子。作为数目众多的一类转录因子家族，bHLH转录因子广泛参与植物的生长发育调控，信号转导，以及逆境胁迫的响应。迄今为止，茶树中还未有关于bHLH转录因子的系统性分析。鉴于此，本研究根据茶树转录组数据库鉴定出120条茶树bHLH转录因子，并且对其功能做了初步的研究，具体结果如下。 1.茶树bHLH转录因子的鉴定结果 本研究基于计算方法从茶树转录组数据库中鉴定出总计120个CsbHLH转录因子，在120个序列中一致性为50％和75％的氨基酸残基分别有23个和8个。CsbHLH TFs在碱性区域平均有5.8个碱性氨基酸，有17条序列的碱性氨基酸的数目小于5个，因此可以暂时认为这些序列不具备结合DNA的能力。其余的103个CsbHLH转录因子可以根据关键位点的氨基酸不同从而结合不同的DNA基序。有5个(4.17％) CsbHLH蛋白具有5个以上碱性氨基酸，但由于缺少Glu-13或Arg-16，不能与E-Box结合。此外，有85个(70.83％)的CsbHLH蛋白在其碱性区域具有His/Lys-9，Glu-13和Arg-17，因此可识别特定类型的E-box即G-box。有五个保守氨基酸（Leu-27、Pro-32、Ala-43、Leu-46、Leu-56）共有超过75％的一致性。其中Leu-27和Leu-56是bHLH结构域中最保守的两个残基，可能在促进蛋白质二聚体的形成中发挥关键作用。根据bHLH氨基酸序列结构并且参考了先前报道的分类系统，将CsbHLH蛋白分为20个亚族。 2.茶树bHLH转录因子的组织表达和儿茶素的测定 为了研究bHLH转录因子在儿荼素代谢中可能扮演的角色，对茶树不同生长阶段的叶片进行儿荼素的测定，同时对类黄酮代谢相关bHLH转录因子进行了组织表达分析。儿荼素测定结果显示EGCG和ECG具有最高的占比，总共占儿茶素总量的约65％～85％。GC和GCG的含量相对较低，分别为1.32～2.60和2.24～4.70 mg·g-1。为了探索4个转录因子与儿荼素代谢的关系，对转录因子的表达水平和儿茶素含量做相关分析。其中CsbHLH027的表达水平与C含量呈正相关(0.96)，而与EC(0.73)和GCG(0.84)的含量呈负相关。CsbHLH033的表达水平和EGC的含量成极显著负相关(-0.93)。CsbHLH038的表达水平与EGC和EC的含量的相关系数分别为0.85和0.81。 3.茶树转录因子的非生物胁迫表达模式 基于茶树在高温胁迫和干旱胁迫的转录组数据，本研究对鉴定出的120个茶树bHLH转录因子计算其FPKM值用来衡量表达量。然后综合序列结构和转录组表达分析的结果，选择了9个表达量较高的转录因子用qRT-PCR技术测定其在四种非生物胁迫下的表达谱（低温，高温，干旱，盐胁迫）。结果显示这9个转录因子都能不同程度的响应非生物胁迫。在冷胁迫处理下，CsbHLH007、CsbHLH012、CsbHLH021和CsbHLH093四个基因的表达量均有不同程度的下降。CsbHLH043、CsbHLH095和CsbHLH079的相对表达水平均有提升。在热胁迫下.CsbHLH012和CsbHLH019都显示出比对照低的表达水平。CsbHLH079、CsbHLH021、CsbHLH093、CsbHLH116和CsbHLH007则在热胁迫中上调表达。在干旱胁迫的情况下，9个CsbHLH基因的表达模式与转录组表达谱结果基本一致，均在干旱处理下有不同程度的上调。在盐胁迫下，CsbHLH007和CsbHLH012的表达水平都下降了。尽管在2h时略有下降，但盐胁迫处理对CsbHLH021的表达水平没有明显的影响。CsbHLH093在早期也有小的波动，在24 h上调了1.6倍。有3个基因（CsbHLH045、CsbHLH079和CsbHLH116)在盐胁迫早期响应迅速。其中CsHLH079的表达量比对照组高7.2倍。CsbHLH043的表达水平随着时间持续增加，并在24 h达到峰值。相反，CsbHLH095的相对表达水平起初相对稳定，之后增加到对照的3.7倍。
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