摘要
果实香气对苹果的品质性状的影响是具有决定性的，果实良好的嗅感能够增加其商品价值，从而获得更大的商业价值。果实香气的合成过程相对复杂，其中研究较为广泛的是的脂氧合酶途径，脂氧合酶基因作为该途径的关键基因引起学者的重视，但具体的作用机理还不清楚。 乙烯对果实的成熟进程具促进作用，被称为果实成熟激素。在多数植物体内，乙烯的响应因子ERFs位于乙烯响应途径的下游，将乙烯信号传递至下游基因，完成乙烯参与果实成熟的转导。不仅如此，乙烯通过PpERF1,PpERF2等调控LOX基因的表达来参与果实香气物质合成过程，但苹果中ERF家族具体参与香气合成的作用机理还不明确。另外，关于MADS蛋白的研究从未停止，尤其是在调控乙烯信号的转导、参与果实成熟以及香气合成等方面。因此，为深入探究上述基因家族的功能，本研究以‘长富2’作试材，通过定量进行基因筛选，克隆MdLOX1a、MdMADS24及MdERF1B基因，对基因功能展开研究，结果如下： 1.在苹果盛花105d后每15d左右取样，测定香气物质的相对含量及乙烯释放速率；通过实时的荧光定量对LOX途径的结构基因，MADS及ERF家族基因表达筛选。结果表明，随着果实成熟，果实香气物质相对含量与乙烯释放量呈上升趋势，MdMADS24、MdLOX1a及MdERF1B显著上调，接下来将其作为目的基因进行探索。 2.在‘王林’愈伤中过表达MdLOX1a发现，实验组香气总含量增加，且部分的成分有不同程度增加,说明MdLOX1a促进香气物质的合成；此外，对此基因启动子元件分析发现启动子上存在MADS家族的结合元件CArG-box的顺式作用元件。 3.将MdMADS24在‘王林’愈伤过表达，转基因验证后，发现其香气物质增加一倍，MdLOX1a上调表达。通过酵母单杂交实验、ChIP及EMSA实验验证MdMADS24特异结合MdLOX1a启动子上的CArG-box元件，LUC实验结果表明MdMADS24蛋白促进MdLOX1a启动子的活性。 4.共转MdERF1B到OEMdMADS24的愈伤中，验证转基因成功后，测定香气物质相对含量及基因表达量，结果显示：较于单转OEMdMADS24，共转试材的香气物质的相对含量增多，MdLOLX1a的表达明显上调。通过酵母双杂交（Y2H）实验、Pull down验证MdMADS24和MdERF1B的蛋白发生相互作用，利用BiFC实验再次验证二者在体内互作产生蛋白复合物，LUC荧光报告实验结果表明：较于MdMADS24的蛋白对MdLOX1a启动子转录的促进，MdBBX24和MdERF1B蛋白的促进作用更为显著。 本研究结果表明：MdMADS24通过与MdLOX1a启动子结合促进后者转录，同时MdMADS24又与乙烯传递途径下游的MdERF1B蛋白-蛋白互作，显著促进MdLOX1a启动子转录活性，进而参与果实香气物质合成。首次揭示乙烯间接参与果实香气物质合成的分子机制，为乙烯参与果实香气品质育种提供理论基础。
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