摘要
人乳寡糖(HMOs)对婴儿的健康和成长有益。作为人乳中最丰富的低聚糖之一，2'-岩藻糖乳糖(2'-FL)已被批准用于婴儿配方奶粉中，其生物合成可以在大肠杆菌内完成，通常是利用T7表达系统重组表达所需的岩藻糖基转移酶及其它相关的岩藻糖代谢蛋白。本论文以大肠杆菌突变菌株S17-3为宿主，表达异源的α-1，2-岩藻糖基转移酶，并对S17-3中高效的可拉酸(CA)合成途径进行基因组编辑，使其提供代谢底物GDP-L-岩藻糖，由此构建新型的2'-FL生物合成途径。 本论文首先针对S17-3进行碳代谢流的优化改造。包括，1）乳糖是2'-FL的合成底物之一，为减少细胞对乳糖的利用，本论文敲除了乳糖操纵子中的lacZ基因;同时对CA操纵子中的wcaJ,wcaI基因进行了基因敲除，因为它们构成GDP-L-岩藻糖利用的竞争代谢途径。结果显示，lacZ和wcaJ双敲菌株最有利于合成2'-FL。2）构建不同的表达系统重组表达不同的α-1，2-岩藻糖基转移酶。研究发现，pxylA启动子表达futC时，重组菌株2'-FL的合成效率最高。本论文随后对基于S17-3的2'-FL生产菌株开展了发酵条件优化，发现影响2'-FL产量的最主要因素为碳源种类及培养基的起始pH。结果表明，当起始pH为4.5、碳源为甘油时，2'-FL的产量能够提升10倍以上，达到0.617g/L。本论文还对S17-3摇瓶发酵细胞高密度生长在不同碳源条件下的数据进行了对比分析，发现当葡萄糖、甘油和乳糖做为碳源时，S17-3均可以实现高密度生长(最大OD600约40)。最后，我们将聚羟基丁酸酯(PHB)合成途径引入S17-3的2'-FL合成系统中，发现菌株的细胞密度(OD600)得到显著提升，在添加了10g/L乳糖和20g/L甘油的LB培养基中，2'-FL的摇瓶发酵产量进一步达到1.029g/L。本项研究既为2'-FL的生物合成提供了一种全新的方案，也为打造S17-3成为岩藻糖基人乳寡糖生产平台的研究奠定了基础。
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