摘要
碱性螺旋-环-螺旋（Basichelix-loop-helix，bHLH）转录因子是真核生物中高度保守的一类转录因子，参与调控多种植物致病真菌的分生孢子产生与发育、菌丝形态和致病力等过程。链格孢（Alternariaalternata）侵染烟草引起的赤星病是烟草生产上的一种重要的叶部病害，条件适宜时可引起暴发性危害，导致烟叶品质下降，香气质差，香气量少，刺激性和杂气增加，已成为烟草优质烟叶生产的一大障碍。 本研究从链格孢中克隆了bHLH转录因子家族，共得到12个基因，分别命名为AabHLH1~AabHLH12。分析发现这12个bHLH转录因子基因编码氨基酸长度差异较大，且同源性很低，但它们都存在一个共同的bHLH结构域，且该结构域位置不固定，有些分布在氨基端，有些分布在中间位置，还有的距离羧基端更近。 利用Linear minimum element法和PEG介导的原生质体转化方法获得了AabHLH1~AabHLH4的基因插入突变体（M1~M4），并对四个突变体进行了回补。通过对比各突变体与野生菌和回补体之间的差异，进行了AabHLH1~AabHLH4四个基因初步的功能分析，结果如下： （1）AabHLH1基因全长1650bp，无内含子，编码一个549个氨基酸的蛋白；AabHLH2基因全长396bp，无内含子，编码一个131个氨基酸的蛋白；AabHLH3基因全长858bp，含有一个99bp的内含子，编码一个549个氨基酸的蛋白；AabHLH4基因全长1317bp，无内含子，编码一个438个氨基酸的蛋白。 （2）AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控链格孢的菌落表型和生长。M1菌落颜色变深，气生菌丝变弱，生长速度降低；M2菌落在PDA上菌丝层变厚，生长速度增加，在MM上菌丝层显著变薄，生长速度较野生菌降低；M3菌落颜色变浅，菌丝层变薄，生长速度略低；M4菌落在PDA上颜色变深，生长速度增加，在MM上颜色较浅，生长速度降低。 （3）AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控链格孢的产孢过程，但影响的阶段不同。AabHLH1基因影响了链格孢产孢和萌发，表现为分生孢子产量降低，萌发时间推迟，萌发率降低，部分孢子喙变长；AabHLH2基因影响了链格孢分生孢子的萌发，表现为分生孢子萌发时间稍有推迟；AabHLH3基因影响了链格孢产孢和萌发，表现为分生孢子产量降低，萌发时间延迟，且自8h后停止萌发，芽管长度缩短，萌发率降低；AabHLH4基因影响了链格孢的产孢和萌发，表现为分生孢子产量增加，菌丝出现节间变短、膨大的现象。 （4）AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控链格孢的黑色素含量。M1~M3菌落黑色素含量均有不同程度的降低，而M4菌落黑色素含量显著升高。 （5）AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控对非发酵型碳源的利用能力。M1~M4菌落在1%乙醇非发酵型碳源培养基上的生长受到抑制，在1%L-阿拉伯糖和1%D-木糖非发酵型碳源培养基上M1~M4的生长均得到促进。 （6）AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控毒素毒力及致病性。M1~M4毒素毒力与野生菌相比均有所降低，其中M4毒力明显低于野生菌；4株突变体致病性也比野生菌低，其中M2致病性严重降低，M3几乎丧失全部致病性。 （7）AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控胁迫应答。M1菌落对盐胁迫和渗透胁迫的耐受性均高于野生菌与回补体；M2菌落对盐胁迫的耐受性较低，而对渗透胁迫的耐受性则稍高；M3菌落对盐胁迫的耐受性较野生菌较低，对渗透胁迫的耐受性与野生菌基本一致；M4菌落对盐胁迫和渗透胁迫的耐受性均比野生菌低。 由此可以推测，AabHLH1~AabHLH4基因均参与了调控链格孢的色素、菌丝形态、分生孢子的产生及萌发、营养生长、对非发酵型碳源的利用力、胁迫应答、毒素毒力及致病力的过程。
NETL