摘要
本文从以下三部分进行了阐述： 第一部分 1.本课题组前期已成功构建C.capillata触手组织cDNA文库，此次利用RNA-seq和de novo组装，基于Illumina Hi SeqTM2000平台成功构建了N.nomurai触手组织转录组，得到118，243条有效Unigenes序列。使用Blastx算法将组装好的unigenes与公共数据库(Nr、Swiss-Prot、Pfam、KOG、GO和KEGG)进行比对，其中15，927个unigenes得到同源注释。在KOG注释中，25，733个unigenes被分为25个功能类别。GO注释中，26，933个unigenes根据生物学进程、细胞成分和分子功能进行了注释和分组。KEGG注释中，有19，423个unigenes富集于包括机体系统、代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程等不同的功能类别中。 2.采用优化后的方法从C.capillata和N.nomurai分离纯化到了两种主要的捕食性刺丝囊，利用光镜和扫描电镜观察其形态学差异，结果发现来自C.capillata的主要是isorhiza型刺丝囊，而来自N.nomurai的主要是mastigophore型刺丝囊。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析刺丝囊内毒素蛋白条带的差异，显示N.nomurai刺丝囊毒素(Nemopilema nomurai nematocyst venom，NnV)中大分子量蛋白(＞40kDa)较C.capillata刺丝囊毒素（Cyanea capillata nematocyst venom，CnV）更多，且NnV的蛋白分子量范围更广。CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测两种刺丝囊毒素的毒性差异并计算IC50值，结果表明NnV的细胞毒性约为CnV的5倍。 3.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳-液相色谱-电喷雾质谱（Liquid chromatography-electrospray ionization/tandem mass spectrometry，LC-ESI/MS）联用的方式，获得CnV和NnV蛋白组分的初始肽段，在CnV和NnV中分别产生了189，309和267，286个MS/MS肽段。肽段匹配数据库分别为：C.capillata和N.nomurai触手转录组数据（自建）、Uniprot动物毒素数据库(Uniprot animal toxin and venom database)、Uniprot分类学刺胞动物门数据库以及通过文献查找的其它已报道的生物毒素信息。通过检索匹配，最终在CnV和NnV中分别鉴定和注释到345和329个蛋白，其中结构蛋白、酶和毒素类蛋白数量最多。经过进一步分析，最终在CnV和NnV中分别鉴定出53和69个毒素相关蛋白。这些毒素亦常见于其他有毒动物，包括一些刺胞动物(Nematostella vectensis，Hydra vulgaris))、蛇(Gloydius ussuriensis，Naja annulifera)、蜘蛛(Loxosceles intermedia、Lycosa singoriensis)、蝎子(Mesobuthus martensii、Lychas mucronatus)等。 4.比较分析后可以将CnV和NnV中共有的蜇伤中毒相关的毒素蛋白大致分为10类：蛋白酶类、磷脂酶、神经毒素、cysteine-rich分泌性蛋白、凝集素、孔道形成毒素、蛋白酶抑制剂、离子通道抑制剂、杀虫活性成分和其他毒素。以上毒素在CnV和NnV之间的构成比例存在明显差异。例如，NnV占比最高的三类毒素是金属蛋白酶、蛋白酶类以及孔道形成毒素，分别占NnV毒素的27.5％、18.8％和8.7％。CnV中最多的三类毒素分别为磷脂酶、神经毒素和蛋白酶类，分别占22.6％、17.0％和11.3％。 该部分结果揭示了中国两种常见的暴发性水母刺丝囊毒素分子的多样性，同时还提示不同水母刺丝囊毒素组分构成比例的不同与其蜇伤效应间可能存在的关系，有望为不同水母蜇伤的治疗提供指导。 第二部分 基于上述推测，将水母刺丝囊提取液经脱盐、HPLC(high performance liquid chromatography)反相C18柱分离后，ESI-MS检测发现一组相对分子质量等差129的系列小分子(依次为：516Da、645Da、774Da、903Da、1032Da、1161Da、1290Da、1419Da)。该系列小分子的分子量均为129的倍数(4～11×)，提示是以129为结构单元的聚合物，且该系列聚合物没有起始单元，为均一的聚合。进一步的氨基酸组成分析发现其仅由谷氨酸（glutamic acid，Glu）一种氨基酸组成。Glu的相对分子质量为147，谷氨酸残基相对分子质量为129，要形成分子量为129倍数的分子结构，有两种可能性：①N端是分子内封闭（焦谷氨酸）的肽链;②环谷氨酸。考虑到谷氨酸的特殊性，其可以γ-羧基形成肽键，因此可能的分子结构有4种类型，即环α、环γ焦谷α、焦谷γ。为了进一步明确其分子结构类型，以6个谷氨酸残基组成的6元肽为代表，化学合成了其所有可能的四种结构类型。最终比对确定，该系列小分子是一组环γ-聚谷氨酸(cyclo-γ-polyglutamic acid，cyclo-γ-PGA)，分别由4-11个谷氨酸残基组成。进一步验证了cyclo-γ-PGA确实具有增加毒素蛋白亲水性和稳定性的作用，且对离体细胞和整体动物均无毒性作用。可见cyclo-γ-PGA具备了优质生物材料的特点，因此本课题第三部分即利用cyclo-γ-PGA作为涂层材料包裹纳米胶束，并深入分析cyclo-γ-PGA作为纳米胶束涂层的潜在优势。 第三部分 1.采用溶剂共挥发法制备纳米胶束，马尔文粒径仪检测显示cyclo-γ-PGA涂层后的纳米胶束的粒径稍增大，聚合物分散性指数（polymer dispersity index，PDI）降低，同时电位发生翻转;透射电镜显示加入cyclo-γ-PGA后纳米胶束周围出现一圈淡色涂层，胶束呈球形，粒径较均一，以上结果表明cyclo-γ-PGA可以成功包裹于纳米胶束周围。 2.cyclo-γ-PGA涂层胶束在高离子浓度以及含血清的培养基条件下，24h累积释放率较未涂层纳米胶束低，说明cyclo-γ-PGA涂层可以增加纳米胶束在不同介质中的稳定性;类似地，溶血实验显示cyclo-γ-PGA涂层可以减少纳米载体与红细胞相互作用，降低溶血率，加强纳米胶束在血液中的稳定性。 3.细胞摄取试验结果表明，cyclo-γ-PGA涂层能够增加细胞对纳米胶束的摄取;进一步利用GGT酶抑制剂GGsTop后证明，cyclo-γ-PGA涂层是通过GGT酶介导的细胞内吞途径来增加细胞对纳米胶束的内化。 4.纳米胶束的还原/光刺激双重响应性能研究显示，当纳米胶束处于pH5.0/10mM GSH条件（模拟肿瘤细胞内环境），72h的累积释放率显著升高，证明纳米胶束具备良好的还原响应特性。光敏效应研究显示，当施加短时光照时，内涵体膜会发生光化学破裂，引发光化学内在化(photochemical internalization，PCI)效应，从而增强纳米胶束的逃逸，促使药物在细胞质内传递。活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测结果显示，cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束处理后的细胞内ROS含量较游离PpⅨ以及其他纳米胶束组更高，一方面证明cyclo-γ-PGA涂层增加了细胞对纳米胶束的摄取，另一方面也表明更多的光敏剂进入细胞产生更多单线态氧 (singlet oxygen，1O2)，为下一步研究纳米胶束光动力治疗奠定了基础。 5.体外抗肿瘤研究表明，cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束较之非涂层纳米胶束展现出更强的肿瘤细胞杀伤作用。活体成像分析显示cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束组展现出良好的肿瘤靶向能力，可以有效减少DOX在其他器官的蓄积，从而降低DOX的毒副作用。体内抗肿瘤试验显示，NLS-LA-PpⅨ-DOX@cyclo-γ-PGA协同光动力治疗能显著提高DOX的在体肿瘤抑制效果，在显著提高疗效的同时，NLS-LA-PpⅨ-D 6.OX@cyclo-γ-PGA极大地降低了DOX毒副作用，表现出良好的安全性。 总之，本部分研究基于水母刺丝囊来源的新型聚阴离子环状小分子cyclo-γ-PGA，构建了一个在血循环中稳定性良好，具有还原/光刺激双重响应性以及GGT受体靶向功能，化疗与光动力治疗协同作用的聚合物纳米给药体系，为抗肿瘤化疗药物输送体系研究提供新思路。
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