巨噬细胞来源CXCL12在动脉粥样硬化中的作用及相关分子机制的研究

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中文摘要：本文主要从以下几个部分展开论述：论文Ⅰ ox-LDL诱导巨噬细胞分泌CXCL12对动脉粥样硬化影响及相关机制的研究研究目的: 1.明确巨噬细胞分泌的CXCL12在动脉粥样硬化发生发展中的作用。 2.明确巨噬细胞分泌CXCL12是否通过影响血管平滑肌细胞(VSMCs)发挥作用。研究方法: 1.建立细胞模型利用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)诱导单核巨噬细胞(THP-1)48小时，使其分化发育成巨噬细胞。然后，使用ox-LDL诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞作为动脉粥样硬化的细胞模型。 2.细胞免疫荧光检测将VSMCs接种于12孔板的盖玻片上，培养过夜。多聚甲醛固定后，使用Triton X-100透化细胞，然后使用BSA封闭。将细胞与抗α-SMA的一抗在4℃下孵育过夜，然后与Alexa Fluor488标记的二抗在室温下孵育1小时。DAPI染色显示细胞核。最后，使用激光扫描共聚焦显微镜检测。 3.HE、免疫组织荧光(IF)或免疫组织化学(IHC)检测取大鼠或小鼠对照组和模型组肺动脉或胸主动脉做成蜡块，切片后进行相应的染色(HE、IF或IHC)。 4.Transwell共培养将VSMCs接种到Transwell板的下室，将THP-1巨噬细胞接种到上室。然后用ox-LDL处理THP-1巨噬细胞。接下来，将VSMCs和THP-1巨噬细胞共培养24或48小时，用于后续实验。 5.细胞增殖检测 VSMCs接种于Transwell板的下室，将THP-1巨噬细胞接种于上室。处理结束后，向VSMCs中加入MTT再培养2小时，最后加入DMSO，用酶标仪测定490 nm处的吸光度。 6.酶联免疫吸附测定(ELISA)检测孵育48小时后收集细胞培养上清（Transwell共培养体系上室和下室），用CXCL12的ELISA试剂盒进行检测。 7.Western blot检测从THP-1巨噬细胞或VSMCs中提取的总蛋白样品，用10％ SDS/PAGE分离。然后，将蛋白条带转移至PVDF膜上，随后用5％脱脂乳封闭。将膜与CXCL12或GAPDH的一抗在4℃孵育过夜。次日，使用1×TBST孵育3次，用HRP标记的羊抗小鼠或抗兔IgG在室温下孵育1小时。用ECL底物检测免疫染色蛋白条带。 8.油红O染色将细胞在载玻片上培养过夜，随后用ox-LDL处理，用4％多聚甲醛固定后，用0.3％油红O对细胞染色20分钟，用显微镜观察并采集图像。 9.RNA提取及qPCR检测 TRIZOL提取细胞总RNA。使用逆转录酶试剂盒将总RNA样品逆转录为cDNA。用SYBR Green qPCR试剂盒进行实时定量PCR测定GAPDH和CXCL12表达的相对水平。 10.siRNA细胞转染及shRNA细胞转染将细胞铺板于六孔板中，培养至50-80％。然后根据使用说明书，Lipofectamine2000转染siRNA，用于后续实验。进行基因shRNA设计，构建载体（由安徽通用生物科技有限公司提供），高纯质粒提取，转染细胞，筛选慢病毒稳转细胞株。 11.流式细胞术检测细胞周期弃掉细胞培养上清，用冷PBS冲洗细胞后，轻吹细胞形成细胞悬液，取100ul的细胞悬液于1.5 mL Eppendorf管中，加入PI（最终浓度为50μg/mL）染料和RNaseA（最终浓度为20μg/mL），避光冰上孵育30min后，用200目滤器过滤细胞，应用流式细胞仪进行细胞周期检测。 12.构建动脉粥样硬化动物模型大鼠动脉粥样硬化模型构建雄性Sprague-Dawley大鼠（12周龄）10只，将SD大鼠随机分为对照组(n=5只大鼠)和模型组（n=5只大鼠）。根据参考文献所述，通过向大鼠喂食高脂饲料加维生素D2三周后建立动脉粥样硬化动物模型。小鼠动脉粥样硬化模型构建雌性ApoE-/-小鼠（8周龄）14只，将小鼠随机分为对照组（n=7只小鼠）和模型组（n=7只小鼠）。根据参考文献所述，通过向小鼠喂食高脂饲料24周建立动脉粥样硬化模型。 13.统计学分析使用GraphPad Prism7.0软件分析所有数据，两组之间的数据比较采用独立样本的t检，P值＜0.05具有统计学差异。实验结果: 1.成功构建动脉粥样硬化的细胞模型并进行相应验证 2.ox-LDL的刺激同样可以促进VSMCs的泡沫化 3.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞促进VSMCs增殖及其泡沫细胞的形成 4.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12促进VSMCs增殖和泡沫细胞形成 5.AS大鼠模型中发病大鼠VSMCs增殖且血清中CXCL12的分泌水平显著升高 6.AS小鼠模型中发病小鼠巨噬细胞分泌的CXCL12显著升高且VSMCs增殖显著增加实验结论: 1.ox-LDL处理THP-1巨噬细胞和VSMCs可以显著提高CXCL12的分泌水平，并能够显著促进其泡沫化。 2.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞可以促进VSMCs的增殖。 3.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞促进VSMCs的增殖是通过分泌的CXCL12来完成的。 4.体内模型中，发现巨噬细胞分泌CXCL12显著提高，VSMCs的增殖亦显著增加。论文Ⅱ ox-LDL诱导巨噬细胞分泌CXCL12及促进VSMCs增殖分子机制的研究研究目的: 1.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌CXCL12是否通过NF-κB信号通路完成。 2.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12是否通过激活VSMCs的MAPK信号通路完成。 3.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12是否通过激活VSMCs的PI3K/AKT/mTOR信号通路完成。研究方法: 1.人单核细胞细胞系THP-1的培养 THP-1细胞用1640培养基(含10％FBS，FBS置55℃灭活30min)于T75细胞培养瓶中，置37℃，5％CO2孵箱中常规培养，细胞呈悬浮生长。收集THP-1细胞悬液，用1640培养基（含10％灭活的FBS，佛波酯PMA10ng/mL，PMA用于刺激细胞贴壁）重悬，计数铺于24孔板中继续培养，进行下一步实验。 2.BMDM诱导实验无菌取C57小鼠后腿，去掉肉留下骨头，用2ml注射器将骨髓吹出，并用反复吹打数次，将骨髓吹散。Tris-NH4CL红细胞裂解液裂解红细胞。重悬细胞并计数。浓度调整为2×106个细胞/ml。10cm培养皿中可加入7-8ml细胞，用BMDM诱导培养基培养，每2-3天换液，去除悬浮细胞，7天可收获成熟BMDM。 3.Transwell共培养将VSMCs接种到Transwell板(3422，Corning，NY,U.S.A.)的下室，将THP-1细胞接种到上室。然后用ox-LDL处理THP-1细胞。接下来，将VSMCs和THP-1细胞培养24或48小时。 4.细胞总蛋白的提取及Western Blot实验吸弃各孔细胞培养上清，每孔加入适量含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，充分裂解细胞，用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白浓度测定。取各孔相应体积的蛋白加入6×蛋白上样缓冲液中，充分混匀，98℃加热5 min，冷却后，可直接将样品用于SDS-PAGE，亦可暂存-20℃或-80℃。根据实验需要取相应体积的蛋白样品及预染蛋白marker上样进行电泳。使用超敏显色液(Thermo scientific，34095)进行ECL法显影。 5.SiRNA转染将细胞铺板于六孔板中，培养至30-50％融合，然后根据生产商的说明，使用Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A.)转染siRNA。 6.小鼠动脉粥样硬化模型 7.统计学分析实验结果: 1.ox-LDL通过NF-κB信号通路诱导巨噬细胞表达分泌CXCL12 2.CXCL12通过激活VSMCs的ERK或JNK信号通路而促进VSMCs异常增殖 3.PI3K/AKT/mTOR信号通路不参与Transwell体系中CXCL12刺激VSMCs的异常增殖 4.白藜芦醇显著减轻ApoE-/-小鼠高脂饮食诱导动脉粥样硬化的斑块面积，高脂饮食的ApoE-/-小鼠如果同时给予白藜芦醇饮水，则显著降低其动脉粥样硬化斑块面积。实验结论: 1.ox-LDL通过激活THP-1或BMDM的NF-κB信号通路的经典途径中p65的磷酸化而促进CXCL12的表达和分泌。 2.参与CXCL12刺激VSMCs增殖的可能效应分子是MAPK信号通路下游的ERK或JNK，而不是p38。 3.PI3K信号通路中的AKT、Raptor或者GSK-3在CXCL12刺激VSMCs增殖中不发挥作用。

作者：

李令兴

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关键词：

动脉粥样硬化巨噬细胞趋化因子血管平滑肌细胞发病机制

授予学位：

博士

学科专业：

内科学（心血管病）

导师：

钟敬泉

学位年度：

2020

学位授予单位：

山东大学

语种：

中文

中图分类号：