摘要
莽草酸(shikimic acid)是生物合成芳香族化合物的重要前体，还是工业生产吲哚衍生物、手性药物如抗病毒药达菲的关键合成原料，具有广泛的药用价值。微生物生产莽草酸主要通过对莽草酸途径(shikimate pathway)进行改造实现的。研究人员通过对重要工业菌种谷氨酸棒杆菌进行传统代谢工程改造，将莽草酸发酵产量提高到141g/L，这也是迄今为止微生物生产莽草酸的最高产量。由于改造思路和策略的局限以及技术手段的相对单一，传统代谢工程手段对莽草酸生产菌株的改造很难在此基础上有进一步的突破和进展。近年来，随着合成生物学的理念被人们广泛接受，研究者们意识到，只有对莽草酸途径有更广泛的认识，对其中涉及的酶学及调控元件有广泛的挖掘和系统的表征，同时开发更高通量的筛选工具和技术，才有望为莽草酸生产菌的改造和产量进一步提升迎来新机遇。 本论文的研究以通过合成生物学手段实现莽草酸高产菌株的构建与筛选作为目标，将谷氨酸棒杆菌作为底盘细胞，首先对莽草酸合成过程中限速步骤的莽草酸脱氢酶这一催化元件进行了全合成元件库的构建与酶学参数的系统表征。随后，采用基于理性设计的研究思路，从催化元件库和文献报道的元件中选择了催化性能最适配的元件进行莽草酸合成模块的组装、调试和优化。实验结果表明人为设计的莽草酸合成模块未能达到预期的高产量。实际上，为了避免这种人为选择元件引入偏差并导致突变株的莽草酸产量与预期不符的现象，研究者们往往会采用“随机筛选”的策略代替“理性设计”的传统思路，对合成模块进行大批量随机组装并对高产组合进行定向筛选。 为了实现对高产莽草酸合成模块的高通量筛选，本研究设计并构建了适用于谷氨酸棒杆菌底盘细胞的胞内莽草酸生物传感器，并对该生物传感器的检测范围、特异性进行了表征;并将该莽草酸生物传感器与流式细胞荧光分选技术(FACS)联用实现了在单细胞水平上对高产莽草酸谷氨酸棒杆菌的高通量筛选，并利用该方法完成了对tktA RBS饱和突变库的筛选工作。此外，作者还拓展了该生物传感器在除高通量筛选之外领域的应用:1）利用该胞内莽草酸生物传感器实现了对莽草酸发酵产量的实时监测;2）通过在生物传感器上引入莽草酸内运蛋白编码基因shiA，构建了莽草酸的全细胞生物传感器(whole-cell biosensor)，实现了对环境中莽草酸浓度的检测。 本论文通过上述两部分研究工作，为今后利用合成生物学手段对莽草酸高产谷氨酸棒杆菌的进一步改造与优化提供了新的策略和技术手段，以及大量高适配性、经过系统表征的催化、调控和检测元件资源。
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