摘要
双酚A(BPA)是一种典型的环境内分泌干扰物(EDCs)，广泛应用于食品包装、玩具、热敏纸等日常生活用品之中，研究表明BPA对人体的生殖发育、神经系统、内分泌系统都具有毒性效应。BPA的检测对保障人体健康具有重要意义。传统BPA检测方法如色谱法和免疫分析法，存在样品前处理过程繁琐，检测成本高，或抗体稳定性差等局限。基于核酸适配体的分析方法能够充分发挥适配体的优点，如化学稳定性高、易实现功能化修饰、结合目标分子构象发生改变。本论文表征BPA适配体的亲和性能，并发展了基于适配体快速检测BPA的传感分析方法。主要研究内容包括以下几点: (1)使用等温滴定量热技术(ITC)和微量热泳动技术(MST)表征BPA适配体序列的亲和性能，鉴别亲和识别中的核心序列和关键碱基。当原始序列(BP60)被裁剪为只含有29个碱基(BP29)时，其对BPA仍具有相当的亲和力。计算模拟表明BP29具有简单的茎环二级结构，该结构的稳定性对适配体和BPA的结合有重要影响。通过依次对适配体进行单碱基突变，研究发现全部G碱基均不能被替换。鉴于该适配体是富G序列，推测其可能会形成末端具有双链互补的茎的G-四链体结构。 (2)结合荧光各向异性分析的优势，利用荧光染料四甲基罗丹明(TMR)标记的适配体，发展了一种简单快速的适配体荧光各向异性分析方法用于检测BPA。适配体与BPA结合时，自身构象发生改变，使TMR和邻近G碱基之间的相互作用受到影响，引起TMR局部转动改变，进而导致TMR的荧光各向异性值改变，由此实现了对BPA的定量检测，检测范围为0.5-1000μM。本方法仅需要利用一条TMR标记的适配体探针在均相溶液中就能实现对BPA的检测，具有简便、快速、成本低的优点。 (3)利用荧光素(FAM)标记的适配体和猝灭基团BHQ1标记的短链互补DNA，发展了一种基于适配体荧光开关检测BPA的方法。当不加入BPA时，适配体和互补短链杂交形成双链，这时的荧光基团和猝灭基团靠近，FAM的荧光被猝灭，体系中荧光信号较低。加入BPA后，适配体和目标分子结合，构象发生改变，互补短链被置换下来，荧光基团和猝灭基团远离，体系的荧光得以恢复。这种方法信号增加明显，具有操作简单、检测快速的优势。 (4)利用末端标记电化学活性基团亚甲基蓝(MB)的适配体修饰的金电极，构建了一种基于适配体电化学传感检测BPA的方法。BPA的结合诱导适配体构象发生改变，导致MB与电极表面的距离减小，方波伏安(SWV)分析中MB电流信号增加。BPA可检测的最低浓度为0.1μM。该方法容易操作，无需额外的试剂。适配体修饰的电极通过去离子水冲洗即可实现再生，电极稳定性好，可多次重复使用。
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