分子生物学的中心法则是现代生物学中最基本的规律之一，而反转录酶催化的反转录反应是其中的关键步骤。反转录酶被推测认为由于缺乏3'-5'外切酶活性而没有校准功能，从而容易引入碱基突变。类似地，也有研究表明反转录酶能够利用3'末端带有单个不匹配碱基的引物进行反转录延伸。但是，引物3'末端出现2个或更多不匹配碱基时，反转录酶是否还能进行延伸还有待阐明。 本研究中，对小鼠脑总RNA中特定的RNA进行反转录，通过定量PCR检测，发现MMLV反转录酶能够利用3'末端带有2个或更多不匹配碱基的引物进行反转录反应，同时也发现AMV和HIV反转录酶也有类似的能力。为了排除总RNA中其它因素的干扰，使用体外化学合成的RNA作为模板，利用定量PCR验证了上述现象。此外，通过尿素聚丙烯酰胺凝胶分析和Southern杂交分析，进一步确认了反转录酶能够利用3’末端带有2个或更多不匹配碱基的引物进行反转录。通过对反转录产生的cDNA进行桑格测序和高通量测序，发现当引物3'末端带有1或2个不匹配碱基时，反转录反应更倾向于直接通过，这和使用完全匹配引物类似，而且cDNA序列中也会相应的掺入1个或者2个突变碱基，观察到的这个现象和之前报道的反转录酶缺乏校准功能相一致。但是，引物3'末端带有1或2个不匹配碱基时，cDNA高通量测序结果中还各自有约8.4％和5.7％的序列和模板完全匹配。此外，当引物3'末端带有3个及以上不匹配碱基时，反转录产生的cDNA主要是和模板完全匹配的序列及部分掺入1或2个突变碱基的序列。更有趣的是，反转录酶也能够利用末端带有2个或者更多不匹配碱基并且末端为双脱氧胞苷(ddC)的引物进行反转录反应，并且得到的cDNA产物中匹配和不匹配序列的分布特征和相应的末端没有ddC的引物相似。这些研究结果表明反转录酶能够直接通过引物末端的1或2个不匹配碱基，同时对于末端带有1或多个不匹配碱基的引物也具有类似校准功能的作用。 更深入的研究发现，MMLV反转录酶或Pfu DNA聚合酶和单链DNA孵育后会导致单链DNA的长度变短，提示MMLV反转录酶具有和Pfu DNA聚合酶类似的外切酶活性。通过体外纯化MMLV反转录酶缺失突变体发现，删除275-361位氨基酸后外切酶活性消失，进一步的缺失突变发现仅275-288位氨基酸缺失也会导致外切酶活性消失。更进一步通过点突变筛选，发现E275A突变体破坏了MMLV反转录酶的外切酶活性，但是对于反转录活性没有影响。更为重要的是，发现E275A突变有效抑制了MMLV反转录酶对于末端带有2个以上不匹配碱基引物的反转录作用。 总之，我们的研究结果表明反转录酶具有外切酶活性，并且该外切酶活性对于末端不匹配引物的反转录作用至关重要。
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