摘要
脂滴(LD)作为细胞代谢过程中高度动态的细胞器，通过脂滴质量控制(LDQC)精密调控LD的生物发生、分裂、融合及选择性脂自噬(lipophagy)等生物学过程，维持细胞内LD数量、大小、分布和运动等物理学特性，介导细胞内LD结构和功能完整性，参与调节外源物诱导的脂质组分代谢稳态和脂毒性结局转归。围脂滴蛋白家族(PLINs)作为调节LD形态和功能的关键因子，介导LD与多细胞器接触通讯（如:LD-溶酶体、LD-内质网等）参与的LD动态依赖性脂质代谢调控和稳态维持。肿瘤抑制因子p53对细胞脂质代谢的调控功能已经在多种损伤研究中进行了深入探讨;新近研究发现p53经由转录非依赖性调控(如线粒体p53)参与介导不同外源物诱导的细胞器应激和质量控制调节、以及细胞毒性转归（如调节性细胞死亡等）。外源物(如:黄曲霉毒素B1(AFB1)诱导的代谢性肝病已日益成为全球关注的公共卫生问题之一，但是，LD动态平衡介导的多细胞器通讯及其蛋白互作机制是否参与以AFB1为代表的外源物诱导脂质代谢失衡关联性肝细胞毒性转归新机制尚待阐明。 目的:通过建立AFB1暴露诱导人肝细胞LD动态变化和线粒体p53高表达的脂质蓄积细胞模型，探讨线粒体p53和脂滴PLIN2蛋白互作在AFB1诱导的线粒体质量控制(MQC)和LDQC稳态失衡所致肝脂质蓄积的调控机制;阐明线粒体p53-PLIN2介导的LD与溶酶体互话通讯在AFB1诱导肝细胞脂自噬和肝毒性转归中的作用，为筛查以AFB1为代表的外源化学物诱导肝脏脂质代谢依赖性肝毒性损伤的新型脂质代谢应答模式和干预靶点提供依据。 方法:(1)GEO分析:筛查非酒精性脂肪肝(NAFLD)相关肝癌小鼠肝组织样本GEO数据库(GSE83596)，分析小鼠肝脏组织中Trp53基因和Plins家族成员基因相对转录水平及其相关性。 (2)体外试验采用AFB1建立LD动态相关腊质蓄积模型并检测相关指标:采用人肝癌HepG2细胞和诱导分化的人正常肝HepaRG细胞。给予棕榈酸PA(0、40、80和120μmoL/L，48h)处理建立脂质蓄积阳性细胞模型，给予AFB1(0、0.625、1.25和2.5μmoL/L，48h)处理进行剂量-依赖性效应观察;选择1.25μmoL/L处理48h作为模型进行相应指标的检测。①蛋白免疫印迹（WB）检测细胞内p53、PLIN2、线粒体分裂融合和脂质合成相关蛋白总蛋白和线粒体转位分布水平;油红O染色观察细胞内脂质分布情况;②试剂盒法检测细胞TC和TG水平;免疫荧光(IF)检测LD探针(BODIPY)标记LD动态;活细胞成像(live cell Imaging)观察BODIPY标记的LD形态及生长动态变化情况;透射电子显微镜(TEM)观察LD形态及其与线粒体结构邻近情况;③IF观察线粒体探针(MitoTracker)标记的线粒体分裂融合变化，ATP检测细胞中ATP水平，评价MQC。 (3)体外试验建立经由线粒体p53与PLIN2蛋白互作介导的线粒体-脂滴细胞器间通讯模型:①构建线粒体靶向p53(OTC)细胞，免疫共沉淀(Co-IP)检测线粒体p53与PLIN2蛋白互作;②“分子对接”分析采用I-TASSER对PLIN2蛋白质3D结构模型以及功能预测;将PLIN2蛋白氨基酸(aa1-437)结构分为aa1-192(N-turminal)、aa193-221(middle motif)和aa222-437(C-turminal)三个结构域，构建高表达PLIN2截短的293T工程细胞株(293T-PLIN2(truncated)s)检测蛋白互作结构域及细胞线粒体-脂滴通讯介导的脂质代谢水平;⑧采用EGFP-PLIN2质粒瞬时转染HepG2细胞，IF观察细胞中分别用BODIPY和MitoTracker探针标记的LD和线粒体形态变化，以及PLIN2线粒体和LD的分布情况;④采用PFTμ处理肝细胞建立线粒体p53靶向干预模型，WB检测p53与PLIN2蛋白线粒体表达分布;IF观察线粒体p53与PLIN2蛋白共定位分布;Livecell Imaging观察LD动态及其与线粒体接触的动态变化。 (4)体外试验建立AFB1处理抑制溶酶体活化介导的脂自噬模型:采用雷帕霉素(Rapa，20μmol/L，12h)干预AFB1处理肝细胞，①WB检测脂自噬相关蛋白(PLIN2，LC3B，p62)表达水平;IF检测分别用BODIPY和LysoTracker探针标记的LD和溶酶体形态变化;Live cell Imaging观察LD形态及与溶酶体接触的动态变化;②采用PFTμ处理肝细胞建立线粒体p53靶向干预模型，检测线粒体p53靶向干预对于细胞LD与溶酶体互话以及脂质代谢水平的影响。 (5)体内试验评价AFB1暴露诱导的脂质蓄积相关肝脏毒性损伤:采用AFB1(2.5mg/kg·bw)隔天灌胃C57BL/6小鼠3周建立暴露模型，并采用p53线粒体抑制剂pifithrinμ(PFTμμ，20mg/kg·bw)建立干预模型。小鼠肝组织样本进行如下检测:①实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织中PLINs家族(Plin1-5)以及LDQC相关基因的mRNA水平;②HE染色观察肝脏组织病理学改变;③免疫组化(IHC)实验检测肝组织中p53和脂自噬相关蛋白(PLIN2，LC3)的表达与分布;④油红O染色观察细胞内的脂滴;⑤提取脂滴相关线粒体(PDM)以及纯化的LD;⑥提取线粒体组分检测肝组织中线粒体上p53、PLIN2表达水平;⑦TEM观察LD、线粒体和溶酶体形态和分布改变。 结果:(1)GEO分析:GSE83596数据分析发现，与对照组(n=14)相比，从脂肪变性到肝癌的小鼠组织(n=18)中Trp53、Plin2、Plin3基因mRNA水平增高，且Trp53分别与Plin2(r=0.6580，P＜0.05)和Plin3(r=0.5204，P＜0.05)之间呈现显著正相关。 (2)AFB1诱导肝细胞LD动态改变和脂质蓄积:与对照组相比，AFB1处理组细胞中，①脂滴蛋白PLIN2、脂质合成相关蛋白SREBP1、PPARγ表达均增加、线粒体分裂蛋白Drp1表达均增加，线粒体融合蛋白MFN2、β氧化蛋白CPT1A表达均下降，p53和PLIN2线粒体转位分布增加;②细胞内油红O染色增加、染色面积增大(P＜0.05）;细胞内TC和TG水平增高（P＜0.05）;提示AFB1诱导肝细胞脂质蓄积暴露模型建立;IF观察发现LD的数量增多和体积增大（P＜0.05），且表现为大直径（≥1μm）LD分布比例增加;Live cell Imaging观察发现LD数量随时间延长而增加、体积增大，呈生长扩张现象;TEM可见细胞内大量LD分布，并与线粒体膜之间存在物理接触;提示AFB1诱导肝细胞LD动态改变及其促进LD与线粒体结构邻近;③IF观察线粒体形态呈碎片化分布;ATP水平降低，提示线粒体功能障碍和MQC稳态失衡。 结论:本研究阐明线粒体p53与PLIN2蛋白互作介导的线粒体-LD接触调节LD动态和脂自噬的分子机制，参与AFB1诱导肝细胞脂质蓄积依赖性肝毒性转归;为探明LDQC调节通路新靶标和作为肝代谢毒性早期标志及其靶向干预提供依据，揭示线粒体-LD接触细胞器网络介导脂质代谢稳态失衡感知模式在肝脏相关疾病发生发展中的蛋白质互作核心机制。
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