摘要
马立克病(Marek's disease，MD)是由马立克病毒(Marek's disease virus，MDV)感染引起的一种免疫抑制病和肿瘤病，是严重危害世界养禽业的重要传染病之一。临床上主要以病鸡的外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润、形成淋巴肿瘤为特征。MD是世界上首例可通过病毒疫苗免疫预防进行有效控制的肿瘤性疾病，所以MDV感染和致瘤一直被认为是研究病毒性肿瘤病发生机制的一种良好的天然模型。 微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约20～24nt的小分子非编码RNA，可以调控多种细胞生物学过程，主要通过降低mRNA稳定性、抑制基因转录后表达水平及蛋白质翻译。MDV编码的miRNA在病毒致病过程中扮演着至关重要的角色，MDV-1基因组中，共编码有26种病毒miRNA，其中miR-M4-5p与宿主原癌基因miR-155同源，miR-155是一种细胞miRNA，主要在造血细胞和免疫系统细胞中表达，在包括人类和鸡在内的大多数物种中都是高度保守的，并且与不同的淋巴瘤有关，在淋巴细胞生物学的若干生理学和病理学过程中起着至关重要的作用。此前研究发现，从基因组中敲除miR-M4-5p可显著降低MDV-1的致病性和致瘤性，表明miR-M4-5p可能是MDV诱导肿瘤发生的重要调控因子。 为进一步揭示miR-M4-5p的调控机制，本研究以CEF细胞总RNA反转录产物cDNA为模板，利用hybrid-PCR技术构建了miR-M4-5p的候选靶基因文库。通过基因克隆、PCR鉴定及序列比对分析，共测序1133个样品，其中有效克隆序列有436个，经BLASTn比对分析后获得128个候选基因序列，有73个基因的3'-UTR存在miR-M4-5p的潜在结合靶点，其中23个3'-UTR结合靶点与miR-M4-5p的种子序列完全互补配对。针对与3'-UTR与miR-M4-5p完全互补配对的23个候选靶基因构建双荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶报告实验进行初步筛选，然后利用双荧光素酶报告实验双突变实验验证miR-M4-5p调控候选靶基因的特异性。利用特异性qRT-PCR分析，对miR-M4-5p与3'-UTR的体内外相互作用以及候选靶基因的表达水平进行分析和验证，最终鉴定DPT、TMEM230和DCLK1为miR-M4-5p调控的宿主靶基因。本研究为后续进一步阐明miR-M4-5p在MD肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础。
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