摘要
目的： 磷酸肌酸（Phosphocreatine,PCr）是一种外源性能量物质，最近报道PCr对氧化因子和炎症因子引起的内皮细胞损伤具有保护作用。然而，PCr预处理对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的单核巨噬细胞（RAW264.7）的影响未见报道。本研究目的探讨PCr对LPS诱导的RAW264.7炎症反应是否具有保护作用、抑制炎症的可能性并探讨可能的初步机制。 方法： 首先，用LPS刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞。采用MTT法，观察并选取PCr对RAW264.7无细胞毒性的适宜浓度；NO检测法优化LPS对RAW264.7细胞诱导的最佳浓度；实验组中加入梯度浓度5.0、10.0和20.0mmol·L-1PCr12h后，加入1.0mg·L-1LPS，对照组单纯加入1.0mg·L-1的LPS，空白组仅加入等体积的PBS。应用流式细胞仪观察RAW264.7的ROS表达；采用Real-time PCR方法检测5.0、10.0和20.0mmol·L-1PCr与细胞培养后炎性相关标志性基因TNF-α、IL-6表达水平；采用Western blot方法检测炎症相关蛋白p-p65和COX2的表达；利用DAPI染色和免疫荧光染色法观察RAW264.7细胞中的p65的表达。 结果： MMT结果显示，PCr在0.2~20mmol·L-1的处理条件下，对RAW264.7细胞无细胞毒性；NO硝酸还原法检测实验结果示，当LPS浓度大于1.0mg·L-1时，LPS对RAW264.7细胞NO的释放与空白组相比有显著上调（P＜0.01），故正式实验选取LPS浓度为1.0mg·L-1诱导RAW264.7细胞；而当PCr预处理浓度为10.0和15.0mmol·L-1时，NO释放量呈剂量依赖性减少，与单纯LPS对照组相比有显著差异（P＜0.01）；通过5.0、10.0和20.0mmol·L-1浓度PCr预处理可抑制过量的ROS产生，LPS+PCr组与单纯LPS对照组相比，ROS产生量有显著差异（P＜0.01）；当实验组PCr浓度为10和20mmol·L-1时，TNF-α表达显著减少（P＜0.01），当PCr浓度为20mmol·L-1时，IL-6的表达也显著减少（P＜0.01）；Western blot结果示，与单纯LPS组相比，LPS+PCr组中p-p65和COX2表达显著减少（P＜0.01）；免疫荧光结果示LPS+PCr组可见细胞核内的p65表达量明显降低。 结论： PCr可以通过NF-κB途径，抑制LPS诱导的单核巨噬细胞RAW264.7炎症反应，未来其在如牙周炎、骨关节炎等炎症性病损中，发挥抗炎症治疗作用具有潜在可能性。
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