摘要
癌症已经成为威胁全人类生命的主要公共健康问题。尽管随着癌症诊断和治疗技术的进步，全球整体癌症死亡率呈小幅下降趋势，但由于发病率的逐年提高，每年因癌症致死的人数却一直居高不下，并呈现上升趋势。以免疫检查点阻断剂（ICBs）（如PD-1/PD-L1抗体）为代表的肿瘤免疫疗法的出现，为癌症治疗带来了新的希望。研究发现，肿瘤内有大量抗肿瘤T细胞浸润的病人（“热”肿瘤）通常对免疫疗法有较好的响应，而瘤内无T细胞浸润的病人（“冷”肿瘤）通常对免疫疗法无响应；并且瘤内T细胞的浸润情况与癌症病人的预后呈正相关。这提示我们，抗肿瘤T细胞的存在对癌症治疗是至关重要的。在众多免疫疗法中，肿瘤疫苗因其具有强大的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞诱导能力，而受到越来越多的关注。然而，由于免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的存在，阻止了疫苗诱导的效应CD8+T细胞的瘤内浸润和发挥抗肿瘤作用。因此，破坏TME促进CD8+T细胞浸润是提高肿瘤疫苗、ICBs等免疫治疗有效性的必要手段。 肿瘤中除了癌细胞外，还包含免疫细胞、周皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）以及细胞外基质（ECM）成分。这些非癌细胞成分相互作用共同构成了TME，并占据了肿瘤质量的大部分。作为TME的重要组成部分，CAFs可以通过分泌趋化因子（如CXCL12和CCL2）、合成ECM成分（如Ⅰ型胶原）及通过PD-1/PDL-L1信号通路等多种途径促进肿瘤发展。然而CAFs是一群异质性细胞，并不是所有的CAFs都具有促癌作用，一些类群的CAFs可以抑制癌症细胞转移。令人高兴的是，多项研究明确了表面表达有成纤维细胞激活蛋白α（FAPα）的CAFs的促癌作用，并且通过基因编辑等手段清除TME内的CAFs可以有效抑制肿瘤的生长。FAPα作为一种肿瘤基质抗原，在超过90%的实体瘤中表达，并且与癌症的进展密切相关。在前期研究中，我们构建了一种以全长人源FAPα为抗原的DNA疫苗（CpVR-FAP），并在FAPα表达丰富的4T1乳腺癌模型上验证了疫苗的抗肿瘤效果。通过CpVR-FAP疫苗靶向FAPα+CAFs可以有效降低TME内的免疫抑制性因素，并促进CD8+T细胞的瘤内浸润。不幸的是，这种疫苗只在模拟术后辅助治疗的模型上有一定延缓肿瘤生长的效果，而在肿瘤已形成的模型上，治疗效果几乎消失。出现以上现象的原因可能有三点。一、疫苗的免疫原性不强，诱导的FAPα特异性T细胞数量不足。二、疫苗诱导产生的抗肿瘤T细胞针对的靶点只有FAPα+CAFs，而缺乏针对肿瘤细胞的直接杀伤作用。三、肿瘤已经形成的模型中包含多种免疫抑制因素（如MDSCs、Tregs和IL-10等），而单独的疫苗不具有消除免疫抑制的功能。因此，要想获得更理想的治疗效果，FAPα疫苗还需要进一步优化，并与其他可以靶向肿瘤细胞的治疗手段联合（例如其他肿瘤疫苗）。更重要的是找到合适的可以消除肿瘤诱导的免疫抑制因素的联合药物来释放疫苗的抗肿瘤活性。 首先，我们对FAPαDNA疫苗进行了优化。新疫苗诱导FAPα特异性细胞免疫和抑制4T1肿瘤生长的能力得到了显著提高，并且在肿瘤已经形成的模型上仍然具有抑瘤作用。此外，新疫苗可以有效降低肿瘤内CXCL12和CCL2的表达，进而降低了TME中骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）的浸润。 接下来，我们构建了可以同时靶向FAPα+CAFs和肿瘤细胞的DNA疫苗。Survivin作为一种理想的肿瘤相关抗原已被应用于制备包括DNA疫苗在内的多种形式的肿瘤疫苗。FAPα/survivin共靶向疫苗（OsFS）的TME调节作用和抑瘤效果更强，并且与FAPα单靶向疫苗（OsF）和survivin单靶向疫苗（OS）相比，进一步延长了4T1荷瘤小鼠的生存时间。在联合多柔比星（Dox）下调荷瘤鼠外周MDSCs后，OsFS的抗肿瘤效果得到了进一步的释放。在4T1皮下肿瘤模型中，与Dox组和OsFS组相比，联合组的抑瘤率分别提高了55.3%和55.4%，生存时间分别提高了26.4%和22.2%。在4T1乳腺原位肿瘤模型中，与Dox组和OsFS组相比，联合组的抑瘤率分别提高了61.5%和100%，生存时间分别提高了33.1%和23.6%。 随后，我们又在另一种FAPα+CAFs较为丰富的Panc02胰腺癌肿瘤模型上验证了OsFS疫苗的治疗效果。但与4T1肿瘤不同的是，Panc02肿瘤并没有诱导荷瘤鼠体内MDSCs的上调，但荷瘤鼠脾脏中的Tregs含量和抗原特异性IL-10的表达水平却很高。这表明不同肿瘤类型在诱导免疫抑制的能力上存在不同。通过吉西他滨（Gem）消除免疫抑制因素后，同样显著提高了疫苗的抗肿瘤效果。在Panc02皮下模型中，与Gem组和OsFS组相比，联合组的抑瘤率分别提高了75.5%和72.8%，生存时间分别提高了52.3%和35.9%。在Panc02胰腺原位模型中，与Gem组和OsFS组相比，联合组的生存时间分别提高了55.7%和37.9%。 最后，为了进一步提高治疗效果，我们又进行了Anti-PD-1对组合疗法影响的初步探索。在Panc02胰腺原位模型中，Anti-PD-1的加入显著提高了组合疗法的治疗效果。与Anti-PD-1组和Gem/OsFS组相比，Gem/OsFS/Anti-PD-1组的生存时间分别提高了159.2%和32.2%。更重要的是，在建模的90天后，Gem/OsFS/Anti-PD-1组中仍然有90%的荷瘤鼠存活。 综上所述，本文首先确定了最优形式的FAPαDNA疫苗，并在此基础上首次构建了以FAPα和survivin为抗原的可以同时靶向FAPα+CAFs和肿瘤细胞的新型治疗性DNA疫苗OsFS。OsFS通过靶向FAPα+CAFs不仅能够通过清除FAPα+CAFs，降低瘤内的免疫抑制因素，来重塑肿瘤微环境（TME），还起到增强疫苗抗原中的survivin诱导的抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。通过联合化疗药物调节荷瘤小鼠的免疫系统，下调免疫抑制因素，显著提高了疫苗对小鼠4T1乳腺癌和Panc02胰腺癌的治疗效果。并且Anti-PD-1的加入更是进一步延长了Panc02荷瘤小鼠的生存时间。本文的研究内容为乳腺癌和胰腺癌的临床治疗提供了新的思路。
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