摘要
本课题组的前期芯片研究表明PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2三个lncRNA在LUSC组织中表达有明显低于癌旁肺组织的趋势。而且通过LUSC测序数据也证明了三个lncRNA在LUSC中的低表达情况，但是PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2三个lncRNA在LUSC细胞中的表达与功能及可能的机制尚未有研究。本课题拟通过real time RT-qPCR检测三株LUSC细胞(NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2的表达水平。并通过构建过表达慢病毒载体，转染NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1三株LUSC细胞系，以获得稳定的过表达PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2的LUSC细胞，接下来通过CCK-8细胞活力检测实验、Celigo划痕实验、PI-FACS细胞周期检测实验、AnnexinⅤ-APC单染法流式细胞仪检测实验等体外实验检测过表达PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2后对LUSC细胞增殖、迁移、细胞周期及凋亡的影响。并通过MEM、Cbioportal及LUSC原创芯片中的差异mRNA寻找PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2的共表达基因，通过GO功能富集、KEGG信号通路及PPI蛋白互作关系分析进一步探讨三个lncRNA在LUSC细胞中的表达与功能及潜在机制。一我们相信随着LUSC机制的进一步研究，以及新治疗靶点的发现，LUSC患者将会从中获益。 第一章 原发性LUSC组织中的长链非编码RNA及mRNA芯片筛选 方法： 1.3份新鲜LUSC组织标本及对应癌旁组织标本的收集 2.对标本进行LUSC lncRNA及mRNA芯片的制备 3.原发性LUSC组织芯片中的差异lncRNA及差异mRNA芯片的筛选。 4.mRNA芯片结果进行GO功能富集、KEGG信号通路及PPI蛋白互作关系分析 结果： 1.通过芯片测序数据发现LncRNA芯片中明显差异表达的LncRNA有 1，564个，其中包括533个上调表达的lncRNA和1，031个下调表达的lncRNA。mRNA芯片中明显差异表达的mRNA有907个，其中包括412个上调表达的mRNA和495个下调表达的mRNA。 2.通过对mRNA芯片结果进行GO功能富集及KEGG信号通路分析发现差异mRNA主要参与细胞信号传导、蛋白质代谢、蛋白质磷酸化、细胞粘附分子的结合、G蛋白偶联受体结合、钙离子及mRNA的结合等过程，并主要富集于肾上腺能信号通路、ECM受体相互作用通路、蛋白质代谢等信号通路。通过PPI蛋白互作分析发现，在蛋白互相作用关系网络中ACTB、ALB、ACTL7B、HDAC1、CPS1、MIB2、UBD、LMO7、ADCY5、EIF4E和PAICS是核心基因。 第二章 基于测序数据的LUSC中lncRNAs的计算生物学分析 方法： 1.LUSC测序数据处理及LUSC中lncRNA芯片筛选 2.差异lncRNA取交集并进一步筛选明显差异表达的lncRNA 3.基于测序数据的LUSC中差异lncRNAs的表达水平检测 4.差异lncRNAs的研究现状分析 结果： 1.通过LUSC测序数据，我们发现LUSC中有5，964个差异表达的lncRNA，其中上调表达的差异lncRNA有1，924个，下调表达的差异lncRNA有4，040个。通过lncRNA芯片数据，我们发现LUSC芯片中有8，397个差异表达的lncRNA，其中上调表达的lncRNA有4，057个，下调表达的lncRNA有4，340个。 2.通过对差异lncRNA取交集发现共有12个差异下调表达lncRNA(CYP2B7P、CHIAP2、SFTA1P、MIR99AHG、HLA-F-AS1、SIGLEC17P、PGM5-AS1、ECEL1P2、LINC00968、FENDRR、SIGLEC16及LHFPL3-AS2)和1个上调表达lncRNA(BBOX1-AS1)。 第三章 LncRNA PGM5-AS1在LUSC细胞中的临床意义、功能及潜在机制 方法： 1.lncRNA PGM5-AS1的表达情况及其与临床病理参数的关系 2.PGM5-AS1在LUSC中的综合分析 3.使用real time RT-qPCR检测三株LUSC细胞(NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中PGM5-AS1的表达水平。 结果： 1.PGM5-AS1在LUSC组织中明显低表达，但仍需大样本的验证。 2.通过SMD(standard mean deviation)综合分析发现，SMD为-3.67（-4.02，-3.32），证实PGM5-AS1在LUSC中是低表达。通过综合诊断效能分析发现，PGM5-AS1在LUSC中SROC为0.97(0.95-0.98)，证明PGMS-AS1有较好的诊断效能。 3.细胞RT-qPCR实验表明PGM5-AS1在LUSC细胞中的表达明显低于正常肺上皮细胞。 第四章 LncRNA HLA-F-AS1在LUSC细胞中的临床意义、功能及潜在机制 方法： 1.lncRNAHLA-F-AS1的表达情况及其与临床病理参数的关系 2.HLA-F-AS1在LUSC中表达及诊断综合分析 3.使用real time RT-qPCR检测三株LUSC细胞(NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中HLA-F-AS1的表达水平。 结果： 1.HLA-F-AS1在LUSC组织中明显低表达，但仍需大样本的验证。 2.通过SMD综合分析发现，SMD为-0.42（-0.67，-0.78），证实HLA-F-AS1在LUSC中呈低表达状态。通过综合诊断效能分析发现，HLA-F-AS1在LUSC中SROC为0.89(0.86-0.91)，证明HLA-F-AS1在LUSC中有较好的诊断效能。 第五章：LncRNA LHFPL3-AS2在LUSC细胞中的临床意义、功能及潜在机制 方法： 1.lncRNA LHFPL3-AS2的表达情况及其与临床病理参数的关系 2.LHFPL3-AS2在LUSC中表达及诊断综合分析 3.使用real time RT-qPCR检测三株LUSC细胞(NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中LHFPL3-AS2的表达水平。 结果： 1.LHFPL3-AS2在LUSC组织中明显低表达，但仍需大样本的验证。 2.通过SMD综合分析发现，SMD为-4.68（-5.08，-4.28），证实LHFPL3-AS2在LUSC中呈低表达状态。通过诊断性分析发现，LHFPL3-AS2在LUSC中SROC为0.94(0.91-0.95)，证明LHFPL3-AS2在LUSC中有较好的诊断效能。 3.细胞RT-qPCR实验表明LHFPL3-AS2在LUSC细胞中的表达明显高于正常肺上皮细胞。 结论： 1.结合课题组前期研究结果，PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2均是LUSC中明显差异表达的lncRNA。 2.PGM5-AS1在LUSC中是一个抑癌基因，在组织及细胞中均为低表达状态，过表达PGM5-AS1在LUSC细胞中可以抑制迁移，促进凋亡，并阻滞细胞周期于S期或者G2/M期。 3.HLA-F-AS1在LUSC中是一个抑癌基因，在LUSC组织及细胞中均为低表达状态，过表达HLA-F-AS1在LUSC细胞中可以明显抑制迁移。 4.LHFPL3-AS2在LUSC组织及细胞中表达趋势相反，表现出一定的差异性，且在不同细胞中也表现出功能的差异性。 5.通过GO功能富集及KEGG信号通路分析初步探讨了PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2在LUSC中可能的分子功能及机制，但仍需迸一步实验证实，对三个lncRNA的研究有望为肺癌的诊断、治疗及预后判断等提供新思路。
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