摘要
第一部分PEP保护HCMVEC细胞免受OGD诱导的损伤 目的： 急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一种常见且严重的心脏病，也是全球心力衰竭和猝死的主要原因，给社会和个人造成了严重的经济负担。本部分主要探究浒苔多糖(polysaccharides from Enteromorpha prolifera ， PEP )对氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)诱导的AMI的影响。在体外通过人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells，HCMVEC)在OGD条件下培养以模拟心脏微血管细胞损伤。然后，研究PEP对OGD诱导的细胞活力、细胞增殖、细胞凋亡、炎性细胞因子表达和细胞自噬的影响。 方法： 本部分实验中，首先使用不同浓度梯度(0、20、40、60、80和100μg/ml)的PEP处理HCMVEC细胞，测定HCMVEC细胞活力，选择PEP的最佳浓度60μg/ml用于后续实验。随后HCMVEC细胞在OGD和/或PEP(60μg/ml)处理后，分别测定其细胞活力、细胞周期相关因子(p53和CyclinD1)的表达变化、细胞凋亡率、细胞凋亡相关因子(Bcl-2、Bax、CytochromeC、Pro-caspase9、Cleaved-caspase9、Pro-caspase3和Cleaved-caspase3)的表达变化、细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)的浓度以及细胞自噬相关因子(LC3-I、LC3-II和p62)的表达变化。本部分研究中，使用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)检测细胞活力；使用碘化丙酯(propidium iodide，PI)和荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocynate，FITC)偶联AnnexinV染色检测细胞凋亡率；使用蛋白免疫印迹分析检测p53、CyclinD1、Bcl-2、Bax、CytochromeC、Pro-caspase9、Cleaved-caspase9、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3、LC3-I、LC3-II、p62以及β-actin的蛋白表达；使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测量HCMVEC细胞的培养上清液中TNF-α和IL-6的浓度。 结果： 本部分实验发现，不同浓度PEP处理HCMVEC细胞后，20、40或60μg/mlPEP处理对HCMVEC细胞活力没有显著影响，而80或100μg/mlPEP处理可以增强HCMVEC细胞活力，为消除高浓度PEP处理本身对于HCMVEC细胞活力的影响，因此实验选择60μg/ml的PEP进行后续实验。在随后PEP处理对OGD诱导的HCMVEC细胞活力、细胞增殖、细胞凋亡、炎性细胞因子表达和细胞自噬的影响实验中发现，与未进行任何处理的对照组相比，OGD可以显著抑制HCMVEC细胞活力，上调周期相关因子p53的蛋白表达水平并下调CyclinD1的表达，提升细胞凋亡率、上调凋亡相关因子Bax、CytochromeC、C/P-caspase9和C/P-caspase3的蛋白表达水平并下调Bcl-2的蛋白表达水平，提高HCMVEC培养上清液中TNF-α和IL-6的浓度，上调LC3-II/LC3-I的蛋白表达水平并下调p62的蛋白表达水平。而与OGD组相比，OGD+PEP组中上述指标的趋势被PEP处理逆转。 小结： PEP可以减轻OGD诱导的HCMVEC细胞活力丧失、增殖抑制、细胞凋亡、炎性细胞因子表达和自噬，对OGD诱导的HCMVEC细胞具有保护作用。 第二部分PEP通过上调HIF-1α改善AMI的体外研究 目的： 本部分以系统研究在体外浒苔多糖(polysaccharides from Enteromorpha prolifera， PEP)改善AMI的保护机制为目的，在PEP能够改善细胞活力下降、增殖抑制、细胞凋亡、炎症因子表达以及细胞自噬保护HCMVEC免受OGD诱导损伤的基础上，以缺氧诱导因子1α(Hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)为切入点，从细胞增殖、凋亡、自噬、信号通路以及心脏功能等方面，在体外深入研究PEP对AMI的保护作用，以期为AMI的治疗提供有力的理论支持和方案策略。 方法： 本部分实验，首先通过OGD和/或PEP(60μg/ml)处理HCMVEC细胞后，检测细胞中HIF-1α的蛋白表达水平；进行si-HIF-1α转染后以降低HIF-1α表达；随后，在OGD和/或PEP(60μg/ml)处理或si-HIF-1α转染细胞后，分别测定其细胞活力、细胞周期相关因子(p53和CyclinD1)的表达变化、细胞凋亡率、细胞凋亡相关因子(Bcl-2、Bax、CytochromeC、Pro-caspase9、Cleaved-caspase9、Pro-caspase3和Cleaved-caspase3)的表达变化；用0-50nMCH5126766处理细胞后，检测HCMVEC细胞中细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases，ERK)信号通路核心因子(t-MEK、p-MEK、t-ERK和p-ERK)的表达变化；细胞通过OGD和/或PEP(60μg/ml)或CH5126766(30 nM)处理后，测量HCMVEC中HIF-1α的蛋白质水平；在OGD和/或PEP(60μg/ml)处理或si-HIF-1α转染后，评估核因子kappaB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)通路核心因子(t-p65、p-p65、t-IκBα和p-IκBα)的表达水平；用0-50nM雷帕霉素处理细胞后，检测HCMVEC中雷帕霉素激酶的机制靶点(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路核心因子(t-mTOR、p-mTOR、t-p70S6K和p-p70S6K)的表达水平；细胞通过OGD和/或PEP(60μg/ml)或雷帕霉素(30 nM)处理后，评估HCMVEC中mTOR信号通路核心因子(t-mTOR、p-mTOR、t-p70S6K、p-p70S6K、LC3-I、LC3-II和p62)的表达水平。本部分研究中，使用CCK-8试剂盒检测细胞活力；使用lipofectamine3000试剂进行细胞转染；使用FITC-膜联蛋白V/PI检测试剂盒检测细胞凋亡率；使用蛋白免疫印迹分析检测HIF-1α、p53、CyclinD1、Bcl-2、Bax、CytochromeC、Pro-caspase9、Cleaved-caspase9,Pro-caspase3、Cleaved-caspase3、t-MEK、p-MEK、t-ERK、p-ERK、t-p65、p-p65、t-IκBα、p-IκBα、t-mTOR、p-mTOR、t-p70S6K、p-p70S6K、LC3-I、LC3-II、p62以及β-actin的蛋白表达。 结果： 本部分实验发现，PEP能够显著上调OGD诱导的HCMVEC细胞中HIF-1α的表达；进行si-HIF-1α转染以下调HIF-1α表达。与OGD+PEP+siNC组相比较，OGD+PEP+si-HIF-1α组中si-HIF-1α降低细胞活力，p53的表达上调而CyclinD1的表达被下调，细胞凋亡率上升，Bax、CytochromeC、C/P-caspase9和C/P-caspase3的表达上调而Bcl-2的表达下调。0-50nMCH5126766处理细胞后，CH5126766处理以剂量依赖性方式降低p-MEK和p-ERK的表达水平。将细胞通过OGD和/或PEP(60μg/ml)或CH5126766(30 nM)处理后，与对照组相比，OGD处理组明显上调HCMVEC细胞中HIF-1α的蛋白表达；与OGD处理组相比，OGD+PEP处理组中明显上调HCMVEC细胞中HIF-1α的蛋白表达；与OGD+PEP组相比，OGD+PEP+CH组中HIF-1α的蛋白表达水平明显下调。将细胞通过OGD和/或PEP(60μg/ml)处理或si-HIF-1α转染后，与对照组相比，OGD处理组上调p/t-p65和p/t-IκBα的表达率；与OGD处理组相比，OGD+PEP处理组中PEP处理下调p/t-p65和p/t-IκBα的表达率；与OGD+PEP+siNC组相比，OGD+PEP+si-HIF-1α组中上调p/t-p65和p/t-IκBα的表达率。0-50nM雷帕霉素处理细胞后，雷帕霉素处理以剂量依赖性方式降低p-mTOR和p-p70S6K的表达水平。将细胞通过OGD和/或PEP(60μg/ml)或雷帕霉素(30 nM)处理后，与OGD处理组相比，OGD+PEP处理组中上调HCMVEC细胞中p/t-mTOR、p/t-p70S6K和p62的蛋白表达，下调C3-II/LC3-I的蛋白表达；与OGD+PEP组相比，OGD+PEP+rapamycin组中下调HCMVEC细胞中p/t-mTOR、p/t-p70S6K和p62的蛋白表达，上调C3-II/LC3-I的蛋白表达。 小结： PEP通过HIF-1α对OGD诱导的HCMVEC增殖抑制和凋亡有保护作用。PEP通过MEK/ERK通路上调HCMVEC中HIF-1α的表达。PEP通过上调HIF-1α减弱HCMVEC中OGD诱导的NF-VE途径激活，并通过促进mTOR信号通路减轻OGD诱导的HCMVEC自噬。 第三部分PEP通过上调HIF-1α改善AMI的体内研究 目的： 本部分研究中，主要在体内研究验证PEP改善AMI的机理，以期在Wistar大鼠中验证PEP通过上调HIF-1α改善AMI的体内研究。 方法： 本部分研究中，首先将获得的40只Wistar大鼠随机分组处理。实验组通过短暂心肌缺血诱导AMI40分钟，然后再灌注，分为AMI组、AMI+PEP组、AMI+PEP+阴性对照(negative control，siNC)组和AMI+PEP+si-HIF-1α组，每组8只大鼠。各组根据实验要求进行预处理。再灌注2小时后处死4只大鼠以测定梗塞面积。将4只大鼠麻醉，在仰卧位固定并进行皮肤准备以测量左室舒张末期直径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。本部分实验中，利用计算机平面测量法量化梗塞面积，使用L14-5WU探针通过M模式超声图像测量左室舒张末期直径LVEDD、LVEF和LVFS。 结果： 本部分通过对大鼠心脏梗塞面积的研究发现，与Sham组相比，AMI组的心脏梗塞面积明显被扩大；与AMI组相比，AMI+PEP组的心脏梗塞面积明显降低；与AMI+PEP+siNC组相比，AMI+PEP+si-HIF-1α组心脏梗塞面积明显增加。通过对心脏功能指标的研究发现，与Sham组相比，AMI组的LVEDD增加，而LVEF和LVES降低；与AMI组相比，AMI+PEP组的LVEDD降低，LVEF和LVES升高；与AMI+PEP+siNC组相比，AMI+PEP+si-HIF-1α组LVEDD明显增加，但是LVEF和LVES明显降低。小结 PEP预处理能够通过上调HIF-1α的表达显著降低Wistar大鼠心脏梗塞面积，降低其LVEDD，并提高其LVEF和LVES指标值，从而对体内AMI发挥保护作用。 结论： 本课题在PEP改善OGD诱导的HCMVEC细胞活力丧失、增殖抑制、细胞凋亡、炎性细胞因子表达和自噬的基础上，以HIF-1α为切入点，探究PEP对AMI的保护作用机制，得出以下结论： (1)PEP可以减轻OGD诱导的HCMVEC细胞活力丧失、增殖抑制、细胞凋亡、炎性细胞因子表达和自噬，对OGD诱导的HCMVEC细胞具有保护作用。 (2)PEP通过MEK/ERK通路上调HCMVEC中HIF-1α的表达。 (3)PEP通过上调HIF-1α减弱HCMVEC中OGD诱导的NF-κB途径激活。 (4)PEP通过促进mTOR信号通路减轻OGD诱导的HCMVEC自噬。 (5)PEP通过上调HIF-1α的表达显著降低大鼠心脏梗塞面积，保护心脏功能。
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