摘要
研究背景： 乳腺癌是成年女性最常见的恶性肿瘤，情志障碍往往伴随乳腺癌始终，表现为心情抑郁、焦虑易怒、睡眠障碍、乏力懒言、强烈负罪感等，严重影响患者的身心健康、人际关系、生活质量和肿瘤治疗效果。目前乳腺癌抑郁障碍尚无统一规范的诊疗指南，临床多参考抑郁症的诊治，以口服西药的方式为主。但由于西药副作用较大，一些药物有可能增加乳腺癌复发转移的风险，加之患者抵触情绪较重、依从性不佳，临床疗效往往不稳定。中医药自古以来就重视情志因素在疾病中的作用，擅长在整体观念的指导下，辨病与辨证相统一，具有安全性高、副作用小的特点，患者接受程度高，临床效果明显，在乳腺癌防治过程中发挥重要作用。 炎性细胞因子是抑郁障碍形成的关键角色，炎性微环境是肿瘤发生发展的重要物质基础，髓系来源的抑制性细胞(MDSC)是恶性肿瘤炎症微环境中大量存在的抑制性细胞，对机体的抗肿瘤细胞免疫应答具有很强的抑制效应。细胞焦亡是细胞程序性死亡方式中的一种，对肿瘤的调控发挥着两面性作用:作为宿主有效防御机制，当肿瘤细胞胞内容物破裂排出到间质中时，可调动机体免疫应答消灭肿瘤细胞炎症因子，但是若肿瘤细胞焦亡不受控制而无限制扩大，在肿瘤微环境中诱发炎症瀑布反应，则会加剧肿瘤进展。焦亡过程中释放的损伤相关分子模式(DAMPs)可使MDSC大量扩增，释放的IL-1β等细胞因子是MDSC的重要活化因子。由此可见，细胞焦亡—MDSC—细胞因子可能是乳腺癌抑郁障碍的重要机制。调控细胞焦亡，抑制MDSC产生、使其失活或促进其分化成熟，是肿瘤抑郁的潜在治疗靶点。 疏肝解郁是中医治疗郁证的常用治法，疏肝健脾方是中国中医科学院广安门医院肿瘤科治疗乳腺癌的经验方，在肿瘤科疏肝健脾法为主治疗肿瘤的基础上，结合经典名方逍遥散凝练而成，主要药物包括柴胡、杭白芍、郁金、八月札、夏枯草、生黄芪、三七、甘草等，临床应用具有较好的效果。课题组前期基础研究显示疏肝健脾方或合并吉西他滨化疗治疗抑郁障碍型乳腺癌小鼠，可抑制MDSC和NKT增殖，减缓CD8+T细胞早期凋亡，上调CD4+/CD8+比值，下调IL-4、IL-6、IL-13、TGF-β和IFN-γ等因子，可改善抑郁荷瘤小鼠生活质量、延长生存期。 因而，我们提出疏肝健脾方可能通过调控细胞焦亡通路，干预炎症因子的大量释放，限制MDSC的扩增和活化，从而改善乳腺癌抑郁障碍。 研究目的 通过建立病证结合的抑郁障碍型乳腺癌小鼠模型，观察疏肝健脾方对抑郁荷瘤小鼠的干预作用，探索疏肝健脾方作用于细胞焦亡调控MDSC的关键环节。 研究方法 基础实验研究分为三个部分:一、建立并评价小鼠抑郁荷瘤模型;二、观察疏肝健脾方对抑郁荷瘤小鼠的干预作用;三、基于细胞焦亡，探索疏肝健脾方治疗抑郁障碍型乳腺癌的作用机制。分述如下: 一、建立并评价小鼠抑郁荷瘤模型 1、将84只雌性BALB/c小鼠右侧第二乳垫下接种2×105个4T1-luc细胞，24小时后随机分成7组:化疗组、中药组、中西医结合组(化疗+中药组)、抑郁荷瘤对照组、单纯荷瘤对照组、单纯抑郁对照组和正常对照组，每组12只，平均分为2笼，按照如下造模给药方式饲养于广安门医院实验动物中心: (1)吉西他滨化疗组(GEM):接种肿瘤细胞且进行慢性温和不可预知性应激抑郁造模。按照120mg/kg的吉西他滨(健择)对小鼠行化学治疗，即分别于接种细胞后的第1、7日，用0.9％氯化钠注射液将健择配成浓度为12mg/mL的溶液后1小时内进行腹腔注射，共2次。 (2)疏肝健脾中药组(SGJP):接种肿瘤细胞且进行慢性温和不可预知性应激抑郁造模。疏肝健脾方(人用量:北柴胡10g、杭白芍15g、广郁金12g、八月札15g、夏枯草15g、生黄芪30g、三七粉5g、甘草6g，每日一剂)，根据前期实验基础，采用每公斤体重小鼠用药量相当于成人(60kg计)临床用量15倍的用药量。自接种次日给予小鼠疏肝健脾方灌胃，共28天。 (3)中西医结合组(GEM+SGJP，简写为:G+S):接种肿瘤细胞且进行慢性温和不可预知性应激抑郁造模。该组动物即如(1)化疗2次，同时如(2)每日中药灌胃治疗28天。 (4)抑郁荷瘤对照组(DT):接种肿瘤细胞且进行慢性温和不可预知性应激抑郁造模。实验期间，在动物伦理允许范围内，无任何治疗措施。 (5)单纯荷瘤对照组(PT):只接种肿瘤细胞，不进行慢性温和不可预知性应激抑郁造模。实验期间，按照实验动物中心规范，正常饲养，自由摄食。在动物伦理允许范围内，无任何治疗措施。 (6)单纯抑郁对照组(PD):不接种肿瘤细胞，只进行慢性温和不可预知性应激抑郁造模。无任何治疗措施。 (7)正常对照组(NC):不接种肿瘤细胞，不进行慢性温和不可预知性应激抑郁造模。按照实验动物中心规范，正常饲养，自由摄食。 2、通过蔗糖水试验、旷场试验和小鼠大脑海马5-HT1AR的测定，判断抑郁障碍模型成功情况。 二、观察疏肝健脾方对抑郁荷瘤小鼠的干预作用 1、监测小鼠体重变化，观察肿瘤生长情况、测量瘤径变化，取材后称量瘤重，计算抑瘤率。 2、流式细胞术检测小鼠脾脏MDSC及其分型含量。 3、透射电镜观察疏肝健脾方对抑郁障碍型乳腺癌小鼠肿瘤细胞焦亡形态的改变。 三、基于细胞焦亡，探索疏肝健脾方治疗抑郁障碍型乳腺癌的作用机制。 1、RT-PCR检测MDSC上游microRNAs:miR-146a、miR-155、miR-21。 2、高效液相悬浮芯片检测小鼠血清细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-17A、TNF-α等。 3、Western-blot检测细胞焦亡通路NLRP3、Caspase-1、ASC等蛋白。 研究结果： 1、建立并完善了2×105个细胞的4T1-luc乳腺癌小鼠模型，接种动物均成模。 2、旷场试验显示:动物活跃程度为:正常组＞单纯抑郁组＞单纯荷瘤组＞中西医结合组＞中药组＞抑郁荷瘤组＞化疗组。单纯抑郁组、单纯荷瘤组与正常组比较没有显著差异(P＞0.05)，抑郁荷瘤组与正常组比较有极显著差异(P＜0.001)。中药组与抑郁荷瘤组比较具有显著差异(P＜0.05)，中西医结合组与抑郁荷瘤组比较具有极显著差异(P＜0.001)。中药组与化疗组比较具有显著差异，中西医结合组与化疗组比较具有显著意义(P＜0.05)。 3、大脑海马5-HT1AR平均光密度表达情况:正常组＞中西医结合组＞中药组＞单纯抑郁组＞单纯荷瘤组＞化疗组＞抑郁荷瘤组，说明慢性温和不可预知性应激会造成5-HT1AR含量减少，单用化疗不能起到改善作用，单用中药效果优于单用化疗，中西医结合则显著改善优于CUMS造成的5-HT1AR含量减少。 4、荷瘤各组肿瘤体积呈现出随荷瘤时间延长肿瘤逐渐增大的趋势，在前8天各组肿瘤体积变化不大，各组间无明显差异，比较后无统计意义(P＞0.05)。8天之后肿瘤体积呈现出如下趋势:抑郁荷瘤组＞单纯荷瘤组＞中药组＞化疗组＞中西医结合组。20天之后，中西医结合组肿瘤体积小于化疗组。差异有统计意义(P＜0.05)。 5、生物发光小动物活体成像观察荷瘤动物体内光子数变化，呈现出与肿瘤体积变化基本相同的趋势，即:抑郁荷瘤组＞单纯荷瘤组＞中药组＞化疗组＞中西医结合组(P＜0.05)。 6、(1)MDSC总含量:抑郁荷瘤组＞单纯荷瘤组＞中药组＞化疗组＞中西医结合组＞单纯抑郁组＞正常组;单纯荷瘤组、抑郁荷瘤组与正常组相比均具有显著差异(P＜0.001)，化疗组、中药组与抑郁荷瘤组比较具有极显著差异(P＜0.001)。(2)Ly6C+Ly6G占MDSC比例:中西医结合组＞单纯抑郁组＞正常组＞中药组＞化疗组＞单纯荷瘤组＞抑郁荷瘤组。单纯抑郁组与正常组比较没有统计意义(P＞0.05)，单纯荷瘤组、抑郁荷瘤组与正常组比较有极显著差异(P＜0.001)。中西医结合组与抑郁荷瘤组比较具有极显著差异，化疗组、中药组与抑郁荷瘤组比较没有统计意义(P＞0.05)。(3)Ly6G+Ly6C-占MDSC比例:抑郁荷瘤组＞单纯荷瘤组＞中药组＞化疗组＞中西医结合组＞正常组＞单纯抑郁组。单纯荷瘤组、抑郁荷瘤组与正常组比较具有极显著差异(P＜0.001)，单纯抑郁组与抑郁荷瘤组比较没有统计意义(P＞0.05)。 7、透射电镜显示各组荷瘤小鼠肿瘤细胞均有不同程度的细胞核皱缩，细胞器空泡化，自噬内吞物等，总体病变程度排序如下:中西医结合组(极轻度病变)＜中药组(轻度病变)＜单纯荷瘤组(中度病变)＜化疗组(重度病变)＜抑郁荷瘤组(严重病变)。 8、(1)小鼠肿瘤组织中miR-146a的表达情况:中药组＞单纯荷瘤组＞中西医结合组＞化疗组＞抑郁荷瘤组。抑郁荷瘤组与单纯荷瘤组比较有显著差异(P＜0.01)，中药组与抑郁荷瘤组比较有极显著差异(P＜0.001)。(2)小鼠肿瘤组织中miR-155的表达情况:抑郁荷瘤组与单纯荷瘤组比具有极显著差异(P＜0.001)。化疗组、中药组与抑郁荷瘤组比较有差异，有统计学意义(P＜0.05)，中西医结合组与抑郁荷瘤组比较具有显著差异(P＜0.01)，化疗组、中药组、中西医结合组三组之间没有明显差异(P＞0.05)。(3)小鼠肿瘤组织中miR-21的表达情况:抑郁荷瘤组与单纯抑郁组比较具有极显著差异(P＜0.001)，化疗组、中药组、中西医结合组与抑郁荷瘤组比较均有差异，有统计学意义(P＜0.05)。化疗组、中药组、中西医结合组三组之间没有明显差异(P＞0.05)。 9、小鼠血清细胞因子含量:(1)IL-1β:与抑郁荷瘤组比较，药物干预后IL-1β的含量均不同程度降低，其中中药组、化疗组、中西医结合组与其相比均有极显著差异(P＜0.001)。(2)IL-18:与抑郁荷瘤组比较，化疗组含量显著升高(P＜0.001)，中药组含量升高具有统计学意义(P＜0.05)。(3)IL-6:与抑郁荷瘤组比较，药物干预后IL-6的含量均一定程度降低，其中中西医结合组降低最显著(P＜0.001)。(4)IL-17A:与抑郁荷瘤组比较，化疗组与中西医结合组的IL-17A的含量均显著升高(均P＜0.001)。(5)TNF-α:与抑郁荷瘤组比较，化疗组与中西医结合组的TNF-α的含量均显著升高(P＜0.001)。 10、小鼠肿瘤蛋白含量表达:(1)NLRP3:化疗组、中西医结合组与抑郁荷瘤组比较有极显著差异(P＜0.001)，中药组与抑郁荷瘤组比差异不大，无统计学意义(P＞0.05)。(2)Caspase-1:中西医结合组与抑郁荷瘤组比较有统计学意义(P＜0.05)，其余各组均无差异(P＞0.05)。(3)ASC:中药组与抑郁荷瘤组比较有统计学意义(P＜0.05)，中西医结合组与抑郁荷瘤组比较具有显著差异(P＜0.01)。 研究结论： 1、疏肝健脾方可明显改善抑郁障碍型乳腺癌小鼠的抑郁状态，联合化疗可控制肿瘤生长、重塑MDSC功能、调控肿瘤炎症微环境。 2、疏肝健脾方通过调控细胞焦亡和炎症因子表达，进而调控microRNA并降低荷瘤鼠脾脏MDSC的含量，逆转肿瘤局部免疫抑制状态。 3、基于NLRP3炎症小体的细胞焦亡通路可能是疏肝健脾方作用于抑郁障碍型乳腺癌的重要机制。
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