摘要
硝化过程是微生物氮循环过程的重要组成部分，在河流、海洋等自然生态环境中发挥着重要的作用，也是污水处理系统中的重要环节。大约一个世纪以前，硝化过程被认为是由两类功能微生物催化进行:氨氧化细菌(Ammonia Oxidizing Bacteria，AOB)和亚硝氧化细菌(Nitrite Oxidizing Bacteria, NOB)分别催化铵氧化过程及亚硝氧化过程。然而，目前对NOB的研究相对较少，严重制约了我们对微生物硝化过程的认知。实际上，亚硝氧化过程是氮素循环过程中的一个重要环节，其中硝化螺旋菌属Nitrospira是分布最广泛、多样性最高的亚硝氧化细菌，在亚硝氧化过程中发挥重要的作用。 本研究设计并优化了用于靶定Nitrospira的引物，并构建了功能基因分析的参考数据库;同时，基于nxrB基因间的进化距离确立了种水平上OTU划分的相似性阈值;在此基础上，利用扩增子测序技术和建立的nxrB基因的多样性分析方法，探究了不同海洋环境中Nitrospira的丰度、多样性以及群落结构分布特征，包括珠江口水体、大亚湾地下河口低渗透性沉积物以及南海水体。同时，基于测定的环境因子，本论文还探究了影响不同生境中Nitrospira群落结构和分布的主要因素。本论文取得的主要结论如下: 1.设计并优化了用于特异性靶定亚硝酸盐氧化菌Nitrospira的功能基因nxrB功能基因的引物，该引物具有良好的特异性及覆盖度;本研究基于收集到的11株纯培养菌序列，通过进化距离的计算确立了以91％的序列相似度作为在种水平上划分OTU的相似性阈值，并通过功能基因参考数据库证实了该结果的可靠性;构建的功能基因参考数据库包含152条序列，且序列长度均大于590bp，该数据库涵盖目前已鉴定种属信息的所有Nitrospira的nxrB基因序列以及环境样品中符合要求的序列。 2.珠江口水体受控于珠江淡水排泄及南海水体入侵，物质浓度梯度及氧化还原电位变化明显，这也导致珠江口较高的Nitrospira丰度及多样性。珠江口水体Nitrospira的平均丰度为7.65×105copiesmL-1水体，从上游到下游丰度逐渐减小。珠江口水体中Nitrospira的优势种群为N.lenta、Ca.N.defluvii及N.marina，从上游到下游N.lenta逐渐演变成主导种群。冬季珠江口水体主要受控于南海水体入侵，这导致海洋属N.marina在冬季相对丰度较高。铵是影响群落结构分布的最主要因素，但不同种属应对环境因子的响应存在差异，这也解释了珠江口Nitrospira的生态位分化。同时，粒径大小、季节对Nitrospira的丰度和多样性均无显著影响。 3.Nitrospira是大亚湾地下河口沉积物中亚硝酸盐代谢的重要菌群。大亚湾地下河口沉积物中，nxrB基因丰度维持在107-108copiesg-1沉积物数量级范围内，高出同区域厌氧氨氧化菌2-3个数量级，与反硝化菌nirS基因丰度相近，这表明Nitrospira可能在大亚湾地下河口沉积物的亚硝酸盐代谢中发挥着重要的作用。低渗透性沉积物中水体停留时间较长，沉积物环境较为稳定，这也为Nitrospira提供了有利的生存条件，从而导致nxrB基因丰度较高。但同时，均质的生存环境也使得Nitrospira多样性较低。秋季大亚湾地下河口的水文动力学主要由海水入侵所驱动，海洋属N.marina随海水进入地下河口，并在有机质存在的条件下快速生长繁殖，这直接导致Nitrospira的主要OTUs均与N.marina亲缘关系较近。 4.Nitrospira在南海水体中丰度较低，并非南海NOB的优势种群，但其多样性较高。南海水体Nitrospira丰度维持在7.7×101到2.7×102copiesmL-1海水，与AOB丰度相近，但比AOA丰度低2-3个数量级。低丰度的Nitrospira无法解释高丰度的AOA与南海水体低的亚硝酸盐水平不相匹配的问题，这表明在富氧的南海水体中可能存在其他NOB介导亚硝酸盐的氧化。南海水体中Nitrospira多样性很高，优势种群为Ca.N.bockiana、N.lenta以及Ca.N.defluvii。其中，大陆架水域的Nitrospira群落结构主要由N.lenta及Ca.N.defluvii组成，而开放大洋Nitrospira的优势种群则为Ca.N.bockiana。值得注意的是，远海未归类的Nitrospira种属逐渐增多。 通过本论文建立的方法对不同海洋生境中Nitrospira的群落结构和生态特征的分析可知:从近海到远海，Nitrospira的丰度及群落结构存在显著差异，其分布特征亦受控于不同的环境因素。近海及大陆架区域，Nitrospira的nxrB基因丰度较高，群落结构主要由N.lenta、Ca.N.defluvii及N.marina组成，而远海Nitrospira的nxrB基因丰度较低，群落组成以Ca.N.bockiana为主导。分布模式的差异可能暗示着在不同海洋环境中Nitrospira在亚硝氧化过程中功能的不同，同时也反映了不同Nitrospira种属对环境的适应性。此外，本论文在珠江口水体及南海水体中均发现Ca.N.defluvii，首次通过扩增子高通量测序技术证实Ca.N.defluvii存在于除污水处理系统外的其他自然生境中。
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