摘要
生物相关分子的检测在生命科学的发展过程中起到了举足轻重的作用。在各种检测方法与技术中，基于非电离辐射的光学成像在生物学和医学中发挥了重要作用。然而传统的光学成像主要集中在紫外-可见光区域。在该区域中，生物组织对光有较强的散射和吸收，此外也存在明显的组织自发荧光。因此，传统光学成像面临着相对较低的组织穿透和较差信噪比的挑战。双光子、近红外荧光成像均采用近红外激光作为激发光，具有更深的组织穿透深度，更少的自发荧光干扰等优势。此外，基于生物发光的探针由于不需要激发光，可以避免因激发光带来的光漂白、组织自发荧光等问题。因此，设计、开发新型的双光子、近红外、生物发光探针，对促进生命科学的发展有着重要意义。基于此，本论文设计合成了一系列基于双光子、近红外和生物发光的功能性分子探针，应用于细胞、体内生物活性物种的检测与成像，具体开展的工作如下： (1)处于紫外-可见光区域的单光子荧光探针，在成像过程中存在激发波长短带来的缺点，如样品光损伤，探针光漂白及样品自发荧光等。与单光子成像技术相比，双光子成像采用两个近红外光子来激发荧光探针。因此双光子成像具有比单光子成像更少的光漂白、光毒性、自发荧光，更好的三维空间定位，以及更深的组织穿透深度等。基于此，在第2章中，我们设计并合成了双光子激光激发的探针FATP1用于活细胞和组织中甲醛的检测与双光子成像。通过在萘衍生物上引入高烯丙基胺基团作为甲醛识别位点，以及对硝基苄基作为猝灭基团，FATP1因发生d-PeT过程，荧光很弱。当FATP1与甲醛反应后，经过2-aza-Cope重排和水解生成双光子荧光染料，荧光增强。FATP1具有较高的选择性及灵敏度，线性检测范围为1.0μM至50μM，检测限为0.2μM。此外，FATP1具有良好的光稳定性及生物相容性，可用于活细胞中外源性和内源性甲醛的双光子荧光成像。在小鼠肝组织的双光子成像中，FATP1显示出较深的组织穿透深度(40-170μm)。 (2)尽管双光子荧光成像相对于传统可见光区的单光子成像具有更深的组织穿透深度，减少的自发荧光干扰及更高的空间分辨率等，双光子荧光成像在活体成像的应用中仍有一定局限性，如对仪器的要求较高，需配备扫描速度达到飞秒级别的脉冲激光器等。另外绝大部分双光子荧光团的发射波长仍处在可见光区，阻碍了更深的组织成像。为了进一步提高发射光的穿透深度，我们开发了近红外光发射的荧光探针用于生物体内的检测、成像。在第3章中，我们设计并合成了近红外探针NC1，用于快速和高选择性检测Cys。NC1对Cys的响应不仅会使得近红外荧光显著增强，同时在近红外区的吸收也显著改变，并伴随着肉眼可见的颜色变化。同时，NC1具有较低的细胞毒性和良好的膜渗透性。基于此，NC1成功应用于活细胞和活体内Cys的检测和成像。 (3)在光学成像领域，需激发光激发的荧光探针在成像时，依然存在着一定的光漂白、自发荧光以及可能会产生单线态氧，损害样品等问题。而生物发光成像不需要激发光，探针在检测与成像过程中不会受到自发荧光的干扰，且无光毒性、无光漂白等现象存在。为了克服上述激发光带来的干扰，在第4章中，我们设计并合成了第一个生物发光探针BP-PN，用于高选择性地检测ONOO-。在荧光素酶底物上修饰α-酮酰胺基团后，BP-PN能够与ONOO-特异性反应并释放出氨基荧光素，然后在萤火虫荧光素酶及辅酶因子的存在下产生生物发光。BP-PN在活细胞和小鼠肿瘤模型中显示出对ONOO-的高信噪比成像。此外，BP-PN成功应用于活体小鼠炎症模型中内源性ONOO-的生物发光成像。 (4)为了验证该生物发光系统具有更广泛的应用，在第5章中，我们设计并合成了第一个生物发光探针BP-PS用于检测H2Sn。通过将D-荧光素用H2Sn识别基团保护后，BP-PS与荧光素酶作用发光很弱。当存在H2Sn时，探针反应生成游离D-荧光素，并在荧光素酶与辅酶因子的存在下发出光子。BP-PS对H2Sn显示出很高的选择性与灵敏度，线性响应范围为0.1至2μM，检测限低至30nM。此外，BP-PS具有出色的生物相容性，可用于LPS和细菌感染诱导的小鼠炎症模型内源性H2Sn的生物发光成像。
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