摘要
Gelonin是从大戟科植物何首乌(Gelonium multiflorum)种子中分离出来的一种植物毒素。它属于Ⅰ型核糖体失活蛋白，可以通过切割真核28S核糖体RNA4324位点的腺嘌呤，诱导核糖体不可逆失活，从而抑制蛋白质合成。Gelonin缺少与细胞膜结合的结构域，因此它对完整的细胞是相对无毒的。尽管少量的Gelonin可以通过内吞方式进入细胞，抑制蛋白质的合成，促进细胞凋亡，但是细胞摄取量很低，而且缺乏组织特异性。因此提高Gelonin的细胞内化效率，同时增强其对肿瘤细胞的靶向性，对于提高其抗肿瘤活性是至关重要的。由于肿瘤细胞的Warburg效应，肿瘤微环境pH值要略低于正常组织。根据肿瘤细胞由于形成酸性微环境，低pH插入肽(pH low insertion peptide，pHLIP)可以在酸性条件下形成跨膜α螺旋，将其C端插入细胞膜且不会破坏细胞膜的通透性。本课题通过原核表达系统成功表达了重组Gelonin(recombinant gelonin，rGel)以及由硫氧还蛋白标签(Trx)、pHLIP和Gelonin组成的重组蛋白Trx-pHLIP-Gelonin(TpG)。本论文主要包括以下三部分研究内容: (1)采用传统的双酶切法、全质粒PCR和无缝克隆等技术构建重组质粒pET28a-pHLIP-Gelonin、pET28a-Gelonin、pGEX-4T-1-pHLIP-Gelonin、pET32a-pHLIP-Gelonin。经过菌落PCR和测序鉴定，以上重组质粒均构建成功。 (2)将构建好的重组质粒转化到表达宿主E.coliBL21(DE3)或者E.coliBL21中，通过摸索表达条件之后，最终分别选择用pET28a-Gelonin和pET32a-pHLIP-Gelonin表达重组蛋白rGel和TpG。两种重组蛋白均带有His标签，通过镍离子亲和层析柱纯化得到重组蛋白rGel和TpG。经SDS-PAGE鉴定及灰度分析得出蛋白的纯度分别达到95％和90％以上。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析表明rGel和TpG的分子量分别为20613Da和50923Da，序列覆盖率分别为48％和37％，表明两种蛋白均正确表达。通过圆二色谱测定了rGel的二级结构和热稳定性，其主要二级结构为β-折叠和无规卷曲，且在20-60℃范围内具有良好的热稳定性。 (3)通过MTT检测rGel对两种结肠癌细胞HCT116和HCT-8的细胞毒性。rGel对HCT116和HCT-8细胞生长的抑制作用具有剂量和时间依赖性。10μMrGel处理72h后，HCT116和HCT-8的细胞抑制率分别为对照组的52.50％和44.31％。通过测定细胞内的蛋白水平，检测rGel的N-糖苷酶活性。与MTT结果一致，rGel以剂量和时间依赖的方式抑制细胞内蛋白质合成。在用10μMrGel处理72h后，HCT116和HCT-8细胞中的相对细胞蛋白水平分别为对照组的14.56％和35.62％。 综上所述，我们成功构建了重组蛋白的表达载体pET28a-Gelonin和pET32a-pHLIP-Gelonin，成功表达了重组蛋白rGel和TpG。细胞实验表明，rGel可以通过内吞作用进入肿瘤细胞内，抑制细胞内蛋白质的合成，诱导肿瘤细胞凋亡。
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