摘要
氧化应激(Oxidative stress)一直以来被认为参与机体生理和病理过程的调控。一方面，氧化应激可通过对生物大分子包括蛋白质、脂质和DNA的氧化修饰，引起氧化损伤，进而导致细胞凋亡。另一方面，氧化应激可参与到细胞信号通路转导途径中，与细胞增殖有着密不可分的关系。由于氧化应激对细胞命运的不同控制，许多疾病的发生与氧化应激紧密相关，例如帕金森病(Parkinson?s disease, PD)和癌症。我们希望通过利用氧化应激在这两种疾病中的作用，采用相应的手段来干预和调控这两种疾病中的氧化应激水平，从而为此类疾病的预防和治疗提供线索。本论文将分别探索两种天然抗氧化小分子熊果苷(Arbutin, Arb)和白藜芦醇苷(Polydatin, Pol)对PD模型的神经保护作用和促氧化小分子16F16A-NO的蛋白质氧化修饰功能及其对肿瘤细胞的增殖抑制作用，并对其作用机理展开研究。 本研究首先建立氧化应激诱导PD细胞与果蝇模型：选用神经毒素鱼藤酮(Rotenone, Rot)诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y产生氧化应激损伤，进而破坏线粒体功能，建立氧化应激诱导PD细胞模型；然后在Parkin基因敲除(Parkin-null)和LRRK2突变(如G2019S位点突变，LRRK2G2019S)果蝇模型上检测Parkin缺失和LRRK2突变表现出的氧化应激易感性，建立氧化应激诱导PD果蝇模型。接下来在建立的Rot诱导的PD细胞模型上对九种天然抗氧化小分子进行筛选，确定具有神经保护活性的小分子Arb和Pol，且二者的细胞毒性较低。 本研究进一步分别对Arb和Pol的神经保护作用的分子机制及其对PD果蝇模型的神经保护作用进行了研究。Arb是从杜鹃花科植物中提取分离得到的苷类化合物，可以通过抑制酪氨酸酶活性发挥抗氧化作用。我们首先利用细胞活性染色、XTT及Westernblotting实验初步确证了Arb具有显著的对抗Rot诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用，而这种对抗作用是通过调节细胞内氧化还原平衡及缓解线粒体功能障碍而实现的。我们进一步研究发现，Arb通过下调Rot诱导所致的AMPK磷酸化上调和p62表达量上升，进而产生神经保护活性效应。接下来，我们给parkin-null及LRRK2G2019S雌性果蝇喂食1mM的Arb，通过透射电镜(Transmission Electron Microscope, TEM)和ATP测定实验表明，25天或45天的Arb喂食均能改善果蝇背部肌肉组织中线粒体功能障碍。此外，行为学测试发现Arb能显著改善parkin-null果蝇攀爬能力障碍，但对于LRRK2G2019S果蝇运动障碍并没有显著的改善效果。我们的研究还发现，Arb添食的parkin-null果蝇飞行翅膀姿势异常现象有所缓解且能逆转LRRK2G2019S果蝇大脑多巴胺(Dopamine, DA)释放量的减少。以上结果表明，在两种PD果蝇模型中，Arb能够通过缓解线粒体功能障碍，实现保护DA神经元的作用。 Pol是白藜芦醇的非糖基化衍生物，是白藜芦醇自然界最丰富的存在形式，其作为一种多酚类化合物，具有直接清除自由基的能力。通过细胞活力、细胞形态及凋亡蛋白表达量测试实验发现，Pol具有显著的神经保护作用。我们发现这种保护作用是通过降低细胞内ROS和RNS水平，调节抗氧化系统平衡及缓解synphilin-1蛋白聚集而实现的。此外，我们进一步研究发现，在Rot作用的细胞中，影响细胞能量代谢平衡的通路中，JNK、c-Jun和AMPK磷酸化水平上升，SIRT1的表达量降低，自噬过程标记蛋白LC3II/LC3I比例下降，表明Rot可能影响到细胞能量代谢平衡，进而使自噬活性受到抑制，而Pol能够逆转这一现象。我们推测Pol很可能通过促进细胞产生自噬而发挥保护作用。为进一步证实此推论，我们采用LC3-EGFP-mRFP双荧光体系来检测自噬动态过程，发现Rot刺激和Parkin基因敲除抑制自噬的发生，而Pol能够缓解自噬受阻现象，且此作用不依赖于parkin蛋白表达。Parkin-null雄性果蝇实验表明，喂食2mM，25天的Pol对PD果蝇的爬行能力有较明显的改善，且飞行翅膀姿势的异常也有所缓解。此外，通过对背部肌肉中线粒体超微结构的分析及ATP水平的测试发现，Pol能够缓解背部肌肉中线粒体功能的异常。免疫荧光实验结果表明，Pol能缓解果蝇前脑后外侧1(Anterior Posterolateral Brain 1, PPL1)区域DA神经元死亡，进而逆转DA释放减少现象。为将Pol应用于临床实验上，我们需确保其在人体内的有效利用度。通过人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)与药物结合实验发现，Pol能和HSA发生有效的可逆结合作用，说明Pol在体内具有比较高的生物利用度。 蛋白质二硫键异构酶(Protein Disulfide Isomerase, PDI )是硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx)家族成员中一种关键酶，通过氧化还原反应介导蛋白质折叠来维持细胞的稳态，在肿瘤细胞中PDI常呈过度表达。首先，我们设计并合成了能够靶向PDI的NO供体分子16F16A-NO，并对其结构进行了谱图鉴定。然后通过分子对接(Docking)模拟实验，验证了16F16A-NO识别并进入PDI蛋白活性空腔的过程。我们进一步在体外水溶液体系中检测到NO较快的释放速率。同时，我们发现16F16A-NO能够抑制PDI蛋白活性及抑制人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和宫颈癌细胞HeLa的增殖作用。此外，我们初步探索到16F16A-NO能对重组蛋白PDI中半胱氨酸进行亚硝基化(S-Nitrosylation, SNO)修饰。 综上所述，我们的研究不仅证实了氧化应激在PD发生发展中的毒性机制，还在PD细胞模型上发现两种抗氧化小分子Arb和Pol具有显著的神经保护作用，并且揭示其相关作用机制及检测了其对PD果蝇模型的神经保护效果。此外，我们证实了促氧化小分子16F16A-NO对肿瘤细胞的增殖抑制作用，初步探索了PDI结构与功能之间的关系。上述研究拓宽了我们对氧化应激的新认识，为氧化应激在疾病中的调控提供一定的理论基础和研究思路。
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