摘要
肝纤维化是指多种致肝损伤因子引起的肝内结缔组织异常增生，导致肝脏内细胞外基质生成与降解平衡失调，继而发展为肝硬化、肝衰竭导致患者死亡。早期肝纤维化通过治疗可以逆转，因此寻找参与肝纤维化发生的关键因子及其作用机制，对肝纤维化的治疗具有十分重要的意义。越来越多的研究表明长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNAs)参与广泛的生物过程，可在多个水平调控基因的表达。本研究在正常及肝纤维化模型小鼠的肝组织中通过芯片技术筛选出一个在肝纤维化组织中表达量升高且具有物种同源性的lncRNA-Tug1，并研究其功能及作用机制，为临床预防和治疗肝纤维化提供新的思路。 方法： 1．构建肝纤维化小鼠模型：腹腔注射橄榄油和四氯化碳(CCl4)建模。取2组小鼠肝组织运用HE染色、天狼猩红染色及免疫组织化学染色和qRT-PCR、WesternBlot检测肝纤维化相关指标以确保造模成功。 2．筛选差异表达的lncRNAs：运用芯片技术，筛选出在肝纤维化中差异表达的lncRNAs，在其中选择一个表达量升高且具有物种同源性的lncRNA，即lncRNA-Tug1。 3．收集正常人和肝硬化患者的肝组织提取RNA，qRT-PCR检测lncRNA-Tug1的表达，同时提取CCl4以及BDL(Bile duct ligation)诱导的肝纤维化模型小鼠的肝组织总RNA，qRT-PCR检测lncRNA-Tug1的表达。 4．提取正常及肝纤维化模型小鼠的原代肝星状细胞和原代肝细胞，qRT-PCR检测lncRNA-Tug1的表达；同时用TGF-β分别处理LX-2细胞以及AML-12细胞后qRT-PCR检测lncRNA-Tug1的表达，揭示并验证lncRNA-Tug1在肝星状细胞以及肝细胞中的表达。 5．敲低和过表达lncRNA-Tug1的慢病毒处理正常小鼠的原代肝星状细胞，qRT-PCR检测lncRNA-Tug1及纤维化相关基因的表达，WesternBlot检测促纤维化基因在蛋白水平的表达。用敲低lncRNA-Tug1的慢病毒处理LX-2细胞，再用TGF-β处理后检测lncRNA-Tug1及促纤维化基因的表达。探究lncRNA-Tug1在肝纤维化中的作用。 6．为了验证lncRNA-Tug1是否可以影响miR-29b的表达，提取正常小鼠的原代肝星状细胞，用敲低和过表达lncRNA-Tug1的慢病毒处理，提取RNA检测miR-29b的表达量。 7．过表达lncRNA-Tug1的慢病毒处理提取的小鼠原代肝星状细胞，分别用miR-29b类似物和阴性对照处理后qRT-PCR、WesternBlot检测纤维化相关基因的表达水平。验证lncRNA-Tug1可以通过下调miR-29b促进肝纤维化的发生。 结果： 1.本研究通过芯片技术在肝纤维化模型小鼠的肝组织中筛选出一个在肝纤维化发生过程中表达量升高且具有物种同源性的lncRNA，即lncRNA-Tug1。 2.在肝硬化患者的肝组织标本中lncRNA-Tug1的表达量明显高于正常人。且在CCl4以及BDL诱导的肝纤维化模型小鼠肝组织中lncRNA-Tug1也升高。 3.提取正常及CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠原代肝星状细胞，检测lncRNA-Tug1和α-SMA的表达，结果显示lncRNA-Tug1表达量升高；TGF-β处理LX-2细胞后，lncRNA-Tug1表达量也升高，揭示lncRNA-Tug1在激活的肝星状细胞中表达量升高。而在原代肝细胞和小鼠肝细胞系AML-12中lncRNA-Tug1的表达量无明显变化，提示lncRNA-Tug1不影响肝细胞的功能。 4.用敲低和过表达lncRNA-Tug1的慢病毒处理正常小鼠原代肝星状细胞，qRT-PCR、WesternBlot显示敲低lncRNA-Tug1可降低纤维化基因的表达，过表达lncRNA-Tug1后促纤维化基因表达也升高；敲低lncRNA-Tug1的慢病毒转染LX-2细胞，再用TGF-β处理后，qRT-PCR及WesternBlot结果显示敲低lncRNA-Tug1后可降低促纤维化基因的表达，证明lncRNA-Tug1可促进肝星状中促纤维化基因的表达。 5.正常小鼠的原代肝星状细胞用敲低和过表达lncRNA-Tug1的慢病毒处理后，qRT-PCR显示miR-29b表达与lncRNA-Tug1呈负相关。而过表达lncRNA-Tug1后用miR-29b类似物及阴性对照处理，qRT-PCR及WesternBlot结果显示miR-29b消除了lncRNA-Tug1对肝星状细胞中促纤维化基因的影响。 结论： 在本研究中，我们通过基因芯片技术筛选出一个在肝纤维化中表达升高且具有物种同源性的lncRNA-Tug1，其在CCl4以及BDL诱导的肝纤维化模型小鼠的肝组织以及肝硬化患者的肝组织中表达量升高。通过体外细胞模型实验得出lncRNA-Tug1在激活的肝星状细胞中表达量升高，并且可以促进肝星状细胞中促纤维化基因的表达，但在肝细胞的中的表达无明显变化。机制上，发现lncRNA-Tug1负性调控miR-29b的表达，并且可以通过下调miR-29b促进促肝纤维化基因的表达从而引起肝纤维化，为肝纤维化的治疗提供了新的依据。
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