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氧化苦参碱通过YAP/RAR途径促进巨噬细胞ABCA1和ABCG1表达抗动脉粥样硬化
王斯琦1
作者信息
摘要
[背景与目的]：心血管疾病(CVD)发病率的不断增高严重威胁着人类的生命健康安全。人类流行病学数据分析表明，动脉粥样硬化(As)性心血管疾病已经成为世界范围内主要的致死原因之一。As是一种以胆固醇代谢异常和炎症反应增强为主要特征的病理生理过程。巨噬细胞内胆固醇代谢平衡破坏导致泡沫细胞的形成是As最主要的病理基础，因此抑制泡沫细胞形成是防治As的重要手段。 三磷酸腺苷结合盒转运体家族(ABCs)作为一类以ATP为能源的膜结合蛋白，能够有效地调节细胞内胆固醇代谢平衡。其中，三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ABCA1)和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G1(ABCG1)可以促进细胞内的游离胆固醇(FC)流出到细胞外乏脂的载脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-I)或新生高密度脂蛋白(nHDL)上，减少细胞内胆固醇蓄积，抑制泡沫细胞形成和As性心血管疾病的发生发展。大量研究已证实，上调巨噬细胞中ABCA1和ABCG1的表达可以改善ApoE-/-小鼠血脂代谢异常，减少ApoE-/-小鼠体内As斑块的形成，表明ABCA1和ABCG1是调控ApoE-/-小鼠体内胆固醇代谢平衡的关键蛋白。因此，进一步阐明ABCA1和ABCG1表达的调控机制对于防治As的发生发展具有重要意义。 中草药中提取的生物碱因具有促进细胞内胆固醇流出、抑制炎症和氧化应激等作用，而被广泛认为是治疗CVD的潜在药物。氧化苦参碱(OMT)——一种从豆科苦参根茎中提取的生物碱，被广泛应用于治疗慢性乙型肝炎。相关研究证实，OMT具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗过敏、抗寄生虫和抗病毒等多种药理活性。同时，OMT还具有明显的心血管保护作用，如逆转心室重构，抗急性心肌缺血损伤，改善慢性心力衰竭大鼠心肌细胞功能和血流动力学等。这些研究提示OMT具有潜在的预防As性心血管疾病的作用，而调节细胞内胆固醇代谢是防治As性心血管疾病的关键办法。因此，本研究旨在探讨OMT是否能够调节细胞内胆固醇代谢的平衡，并且这种调节是否依赖于ABCA1和ABCG1实现。此外，对ApoE-/-小鼠附睾脂肪组织的蛋白质组学分析表明，高脂肪饮食喂养会引起小鼠体内Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)表达的改变。并且，一些研究表明降低细胞内YAP表达是潜在的保护心血管系统功能的方法。这些发现进一步启发我们探讨OMT发挥心血管保护作用是否与抑制YAP表达相关。 [方法]：CCK8法检测OMT对THP-1源性泡沫细胞的细胞活性的影响，筛选药物处理的合适浓度。最适浓度OMT培养THP-1源性泡沫细胞，高效液相色谱检测细胞内胆固醇含量，液体闪烁计数仪检测细胞内[3H]标记胆固醇的流出情况，qRT-PCR和Westernblot检测ABCA1、ABCG1以及相关蛋白的mRNA和蛋白表达水平。随后，进一步采用qRT-PCR和Westernblot检测OMT处理后ABCA1和ABCG1相关调节蛋白的表达水平。筛选出RARα和RARγ表达受OMT调节后，运用RARα抑制剂Ro41-5253或RARγ抑制剂MM11253处理已经加入OMT的THP-1源性泡沫细胞，检测RARα和RARγ对OMT调节细胞胆固醇流出作用的影响。随后，分别病毒转染RARαsiRNA、RARγsiRNA和YAP过表达载体，在证实转染有效后检测OMT对相关蛋白表达的影响，以验证RARα、RARγ和YAP在OMT调节ABCA1和ABCG1表达中的作用。最后，用60mg/kg的OMT对高脂喂养的ApoE-/-小鼠进行不同时长的腹腔注射，采用Masson、HE和油红O染色评估ApoE-/-小鼠心脏主动脉瓣膜内斑块的形成情况；采集ApoE-/-小鼠血浆，检测OMT处理对小鼠血脂成分的影响；收集ApoE-/-小鼠主动脉，经剪碎研磨后，采用qPCR和westernblot检测其主动脉中ABCA1和ABCG1蛋白表达的变化情况。 [结果]：CCK8法测定处理THP-1源性泡沫细胞的最佳浓度为80μM。高效液相色谱检测表明OMT有效减少THP-1源性泡沫细胞内总胆固醇(TC)、FC和胆固醇酯(CE)的含量。随后，液体闪烁计数仪检测发现OMT促进ABCA1和ABCG1所介导的胆固醇流出，qRT-PCR和Westernblot证实OMT有效上调ABCA1、ABCG1、RARα和RARγ的表达。RARα和RARγ的抑制剂和siRNA处理证实OMT调节ABCA1和ABCG1表达依赖于RARα。生物信息学检测发现YAP和RARα存在相互作用。进一步Westernblot检测证实OMT减少YAP蛋白表达从而促使RARα介导的ABCA1和ABCG1表达增加，而过表达YAP则下调RARα、ABCA1和ABCG1的表达。证实了OMT促进ABCA1和ABCG1的表达依赖于YAP/RARα途径。通过检测ApoE-/-小鼠心脏主动脉瓣切片的染色面积发现，OMT显著抑制小鼠体内As斑块的形成；血脂分析显示，OMT增加ApoE-/-小鼠血浆HDL-C水平。 [结论]：OMT通过YAP/RAR途径促进巨噬细胞ABCA1和ABCG1的表达及胆固醇流出，从而抑制动脉粥样硬化的发生发展。
关键词
动脉粥样硬化/氧化苦参碱/三磷酸腺苷结合盒式转运蛋白A1/三磷酸腺苷结合盒式转运蛋白G1/胆固醇流出引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
基础医学导师
唐朝克学位年度
2019学位授予单位
南华大学语种
中文中图分类号
R5