摘要
研究背景： 胆管癌(Cholangiocarcinoma)是一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，从解剖学上分为肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，IHCC)和肝外胆管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma，EHCC)，其发病率约占消化系统恶性肿瘤的3％，在肝胆系统原发恶性肿瘤居第二位，其男女发病率之比约1.5∶1。目前胆管癌发病机制尚不明确，恶性程度较高，早期诊断困难，手术切除率很低，因此病死率较高。未经治疗的胆管癌出现临床症状后平均存活时间约3～4个月。胆管癌发病率近几年来有逐渐增加的趋势，该病早期症状不明显，诊断明确时已多为中晚期，手术切除是该病根治的唯一手段，但是术后5年生存率仍低于5％，目前临床上还没有一种确切的胆管癌预后标记物。曾有报道发现一些分子生物学标记物与胆管癌的不良预后及肿瘤进展有一定关联，比如MUC1，MUC4，fascin，表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)等，但是大部分都没有常规用于临床。因此，寻找新预后相关生物学标记物及个体化治疗研究显得非常迫切和必要。 泛素连接酶能够将泛素分子连接到目的蛋白质的某个赖氨酸上。根据靶蛋白所加的泛素链的结构，泛素链的不同长短，以及泛素连接酶E3与底物的不同比例，可以将底物单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。一般情况下都是多聚泛素化修饰，是指泛素连接酶将目的蛋白质加上多个泛素分子，然后靶蛋白一般被26S的蛋白酶体所降解，此途径被称为泛素蛋白酶体途径，简称泛素化途径。真核生物中泛素蛋白酶体途径是己知的最为重要的蛋白质降解途径。此外，在个别情况下，泛素连接酶在目的蛋白质上只连接一个泛素分子，即单泛素化修饰，这种情况下蛋白质不被蛋白酶降解。单泛素化修饰是一种调节信号，可以引起靶蛋白的活性、定位以及蛋白质结构的改变从而对蛋白质的功能以及蛋白质核内的定位进行调节。因此蛋白质的泛素化过程并不一定是导致细胞死亡。 Cullin-RING家族是哺乳动物体内最大的E3泛素连接酶家族，其中cullin蛋白作为支架参与CRLs(Cullin-Ring E3 ligase)蛋白复合体的构成，在信号转导转录、肿瘤抑制、DNA复制及修复、细胞周期、生长发育等过程发挥重要调节作用。RING家族的E3能够将活化的泛素从E2直接转移到靶蛋白，其本身与泛素并不发生作用。人类Cullin家族目前包括8个成员，分别是Cul1、Cul2，Cul3、Cul4A、Cul4B、Cul5、Cul7和Cul9。Cul4A和Cul4B具有高度同源性。Cul4B是CRLS复合物的一种支架蛋白，参与细胞周期进程、DNA复制和DNA损伤反应等多种生物学过程的调控。不同于Cul4A，Cul4B的N端携带了一个核定位信号，并且位于核内，这提示Cul4B可能参与细胞核的一些功能。目前研究发现，Cul4B基因突变与X连锁精神发育迟滞有因果关系。Cul4B在多个实体瘤中过度表达，如肺癌、结肠癌和肝癌等。并且Cul4B的表达与肿瘤临床病理分期呈正相关，这提示Cul4B对肿瘤的发生发展具有促进作用，Cul4B对肿瘤侵袭和进展的作用尚不清楚。Cul4B可能以多种方式发挥其致癌性。本课题组前期对Cul4B在不同实体恶性肿瘤中的分子机制进行了研究，包括肺癌、食管癌、肝癌、前列腺癌，并取得了一些发现和成果。基于前期的研究，本课题对Cul4B在胆管癌中的表达特征及促进胆管癌恶性进展的分子机制进行了研究，以期在探索胆管癌新的诊断途径、预后指标和治疗靶点。 目的： 1.在胆管癌临床标本中利用免疫组化技术检测Cul4B的表达，结合临床病理资料和随访资料探讨Cul4B的表达与胆管癌发生发展以及预后的关系。 2.通过构建针对Cul4B的过表达和干扰载体，利用脂质体转染技术将两种载体分别转染不同的胆管癌细胞构建Cul4B过表达和沉默的胆管癌细胞系，进而通过细胞实验研究Cul4B对胆管癌细胞增殖、侵袭以及转移等生物学行的影响，并进一步探讨Cul4B影响胆管癌发展的分子生物学机制。 方法： 1.为了明确Cul4B在胆管癌发生发展中的作用，我们对219例胆管癌标本进行了免疫组织化学染色。分别在肝内胆管癌和肝外胆管癌患者中分析了Cul4B的表达与常见临床病理指标，病理学分期、年龄、性别、肿瘤大小、组织分化程度及淋巴结转移之间的关系，以及与EGFR表达的关系。 2.为了评估Cul4B表达和患者生存率之间可能的相关性，我们采用了Kaplan-Meier曲线和对数秩检验来评估整体生存率。 3.我们研究了在肝外胆管癌患者中是否能够联合Cul4B和EGFR来进一步提高预测预后的结果。为此，我们对所有肝外胆管癌病例按照其Cul4B和EGFR表达情况(低表达/过度表达)进行分组。在Kplan-Meier分析中采用EGFR和Cul4B均低表达组作为参考。 4.为了在体外研究Cul4B在胆管癌中的生物学作用，我们首先运用WesternBlot和qRT-PCR检测Cul4B在胆管癌细胞株(QBC939、HUCCT1、RBE)中的表达。在Cul4BsiRNA敲减的QBC939胆管癌细胞株和在Flag4B质粒转染Cul4B过表达的RBE细胞株中通过MTS检测观察细胞增殖变化。采用transwell试验来评价胆管癌细胞的迁移和侵袭能力的改变。 5.为了研究在胆管癌中Cul4B是否为上皮细胞间质转化的调节因子，在Cul4BsiRNA敲减的RBE胆管癌细胞株中，通过WesternBlot分析了上皮标记物(E-钙粘蛋白)和间质标记物(波形蛋白和N-钙粘蛋白)的变化。 6.为了研究胆管癌中Cul4B的致癌机制，我们在QBC939细胞株中通过siRNA转染敲除Cul4B，然后通过Real-timePCR测定抑癌基因p16和PTEN的变化。 结果： 1.胆管癌细胞的Cul4b蛋白水平高于癌旁良性导管上皮细胞。总的来说，Cul4B在28.6％(40/140)的肝外胆管癌病例和26.6％(21/97)的肝内胆管癌病例中过度表达。在肝外胆管癌病例中，Cul4B过度表达与肿瘤的病理学高分期(P=0.024)和淋巴结转移(P=0.013)显著性相关，而与性别(P=0.821)、年龄(P=0.520)、肿瘤大小(P=0.650)和组织分化(P=0.299)无显著性相关性。相比之下，在肝内胆管癌病例中，Cul4B表达与所有临床病理因子均无相关性。在76例肝内胆管癌病例中19例(25.0％)EGFR过度表达，在138例肝外胆管癌病例中23例(16.7％)EGFR过度表达。在肝外胆管癌病例中，Cul4B过度表达和EGFR表达具有一定的相关性(P=0.093)，而这种相关性不存在于肝内胆管癌病例中。 2.Cul4B过度表达的病例具有较低的整体生存率。Cul4B过度表达病例相对于低表达的预期平均生存时间(分别为55.029±2.595和86.974±0.882月，P＜0.001)具有显著性差异。相比之下，在肝内胆管癌中，二者不具有显著性差异。单变量Cox回归分析显示Cul4B过度表达是肝外胆管癌的癌症致死率的预后指标((hazardratio=1.779，95％CI=1.102-2.690，P=0.028)。此外，组织学分化、肿瘤分期、UICC分期和EGFR表达也都与整体生存率显著相关。在多变量分析中，UICC分期和EGFR的表达仍具有预测价值，而Cul4B表达则没有。在肝内胆管癌中，Cul4B表达与胆管癌的整体生存率无相关性。单因素分析显示4个因子，包括肿瘤大小、淋巴结转移、UICC分期和EGFR表达可以作为预后因子。多变量分析中只有UICC分期和淋巴结转移是独立的预后因子。总之，这些数据显示Cul4B在中国肝外胆管癌患者中是一个不良的预后因子。 3.在Kplan-Meier分析中显示，相对于EGFR和Cul4B至少其中之一表达阴性的其他三组，EGFR和Cul4B均过度表达组病例预后最差。 4.三株胆管癌细胞株中，QBC939细胞株Cul4B蛋白水平表达最高，HUCCT1和RBE细胞株Cul4B蛋白水平表达较低(QBC939＞HUCCT1＞RBE)。MTS检测结果发现，与对照组(NC)比较，干扰Cul4B表达后，QBC939细胞株增殖显著性减弱(P＜0.05)。应用Cul4BsiRNA分别处理QBC939细胞48小时和72小时后，细胞增殖率分别减少了20.7±3.5％和27.9±5.6％(P＜0.05)。同时，我们在QBC939细胞株中对Cul4B进行了过表达。转染了表达Cul4B质粒后，RBE细胞株的生长显著增加。值得注意的是，相对于阴性对照，Cul4B的过度表达显著增加了HUCCT1细胞增值率，反之亦然。transwell试验表明，Cul4B敲低后，QBC939和HUCCT1细胞株迁移和侵袭能力显著降低，相反，过表达Cul4B后显著提高了HUCCT1和RBE细胞株的迁移和侵袭能力 5.用siRNA瞬时性敲低Cul4B后，Westernblot显示QBC939和HUCCT1细胞中，E-钙黏蛋白的表达显著下调，而波形蛋白和N-钙黏蛋白则上调。这提示Cul4B可能促进EMT。 6.在QBC939细胞株中通过siRNA转染敲除Cul4B导致p16和PTEN均上调，这提示Cul4B能促进肿瘤进展部分是通过抑制这些抑癌基因来实现的。 结论： 1.Cul4B在胆管癌组织中过度表达。 2.EGFR和Cul4B均过度表达的胆管癌患者预后差。 3.Cul4B在中国肝外胆管癌患者中可以做为一个的胆管癌不良预后判定指标。 4.Cul4B促进胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭，其机制可能与Cul4B促进EMT有关。 意义： 1.首次在胆管癌细胞中发现Cul4B可以促进上皮细胞间质转化。 2.首次研究发现在中国人肝外胆管癌中Cul4B过度表达可以作为一个不良的预后因子。Cul4B在外科切除的胆管癌组织中过度表达有助于预测患者的整体生存率。特别是我们的研究发现Cul4B和EGFR共同表达的胆管癌病例预后不良。 3.为Cul4B作为新的胆管癌治疗靶点提供了实验依据。
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