摘要
[背景] 寨卡病毒病是由寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)感染引起的以头痛发热、皮疹、关节疼痛或结膜炎为主要临床表现的自限性急性传染病。寨卡病毒可通过虫媒、母婴和性途径传播。持续性寨卡病毒感染可导致雄性不育，且ZIKV可感染神经元前体细胞导致婴儿小头症。目前还没有可用于治疗ZIKV感染的疫苗或特效药物，因此探索新型抗寨卡病毒预防性疫苗或者小分子药物具有重要的意义。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是动植物进化保守的抗感染固有免疫小分子多肽，是一类天然阳离子宿主防御肽，有广谱的抗细菌真菌活性。其中，抗菌肽cathelicidins是脊椎动物来源的一个重要的抗菌肽家族，人cathelicidin为LL-37，小鼠cathelicidin为CRAMP。已有报道显示抗菌肽cathelicidins能够显著抑制部分包膜病毒如呼吸道合胞病毒、鼻病毒的感染，近期有研究体外发现人LL37衍生肽可在体外抑制ZIKV活性，但cathelicidins抗菌肽在动物体内的抗ZIKV功能及其对寨卡病毒疾病的影响和作用机制还未见报道。 [目的] 为明确抗菌肽cathelicidins是否具有直接抵御ZIKV的功能及其机制，探索其体内保护ZIKV感染小鼠诱导的睾丸损伤和不育的作用及机制。 [方法] 1.ZIKV经尾静脉或直接睾丸内注射感染C57BL/6J小鼠。 以2×106PFU的ZIKV经尾静脉注射小鼠，诱导睾丸、脑内病毒在第4天的复制表达高峰，第8天出现轻微的急性睾丸损伤;1×103PFU直接睾丸内注射C57BL/6J小鼠，60天后小鼠睾丸尺寸减少50％、重量减轻50％;总精子数减少80％，睾丸病理提示严重退化，生精细胞萎缩、管腔空泡。 2.ZIKV病毒载量、滴度的检测。 取感染小鼠睾丸、脑和脾脏，以RT-PCR检测不同时间点各组织内ZIKV表达水平。取各组细胞培养上清10-1-10-10梯度稀释，使用VeroE6细胞进行病毒滴度检测。按照Reed-Muench方法计算ZIKV的TCID50，即TCID50=lg(大于50％病变阳性率的稀释度)+(大于50％病变阳性率的百分数-50)/(大于50％病变阳性率的百分数-小于50％病变阳性率的百分数)。 3.小鼠睾丸病理检测。 取感染各时间点小鼠睾丸于4％甲醛固定，48hr后脱水包埋进行苏木精-伊红染色(HE染色)。同时迅速摘取附睾，将其置于37℃预热的1ml培养基中，并将每只附睾尾部分为3段，放于37℃培养箱30min等精子游出，随后立即通过显微镜在血细胞计数器上手动计数运动和非运动精子。总精子数量等于运动和非运动精子的总和。 4.小鼠CRAMP蛋白检测。 取感染第0、2、4、8天小鼠睾丸、脑和脾脏一半于4％甲醛中固定48hr后脱水包埋。切片后得到睾丸组织白片，通过免疫组化检测各组织中CRAMP蛋白的表达。另一半制备组织匀浆液，按照试剂盒说明书进行CathelicidinELISA检测。 5.ZIKV体外感染VeroE6细胞试验。 以MOI=2的ZIKV感染VeroE6细胞，同时加入20μg/ml的CRAMP/LL-37，2h后弃去感染上清，换为新鲜培养基，补加相同剂量的AMP，37℃培养至48hr。通过RT-PCR检测Zika病毒载量变化，免疫荧光和WesternBlot分别检测病毒包膜蛋白E以及非结构蛋白NS3的表达。 6.ZIKV感染诱导细胞外囊泡(EV)的检测。 收集VeroE6细胞培养物上清以4℃10，000g离心45min除去细胞碎片，并将澄清上清通过0.22μm过滤器过滤后加入超速离心管，通过ExosomePurificationKit按照试剂盒说明书纯化分离EV。将分离得到的EV送生物公司进行纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测EV的大小和结构;进一步通过WesternBlot检测EV颗粒蛋白质裂解物中EV标记物TSG101、CD63和Alix的表达。 [结果] 本研究通过体外和小鼠ZIKV感染模型探索了抗菌肽cathelicidins对ZIKV的抑制作用及其作用的机制，主要结果如下: 1.ZIKV经尾静脉感染或直接睾丸内注射小鼠建立ZIKV感染和急慢性睾丸损伤模型 以2×106PFU的ZIKV经尾静脉感染C57BL/6J小鼠，0-8天病程中发现:感染小鼠睾丸、脑和脾脏组织的ZIKVRNA表达从第2天起显著增高，第4～6天在睾丸和脾脏达到峰值，随后逐渐下降;第8天诱导轻微的急性睾丸和脑组织坏死损伤。以1×103PFUZIKV直接睾丸内(IT)注射方式破坏血睾屏障，发现感染至30天，小鼠睾丸尺寸显著缩小，睾丸重量下降30％，总精子数和活动精子数分别显著降低76％和60％，间质细胞退化，管腔内空泡，生精细胞紊乱，提示诱导了ZIKV感染及睾丸急慢性损伤模型。 2.CRAMP在ZIKV感染小鼠睾丸中显著上调表达 RT-PCR检测鼠源cathelicidin-CRAMP在ZIKV感染小鼠各组织器官内的动态表达，结果显示:ZIKV感染后，CRAMP的RNA表达水平在睾丸和脑显著上调，在脾脏无表达;CRAMP蛋白水平亦被ZIKV显著诱导上调表达，第4天达峰值随后下降。提示ZIKV病毒感染小鼠诱导急性睾丸损伤过程中，小鼠睾丸组织CRAMP蛋白显著上调，动态表达曲线与病毒复制曲线吻合。 3.抗菌肽cathelicidins在体外可直接抑制ZIKV感染复制活性 我们首先在体外研究人源cathelicidin-LL-37及鼠源cathelicidin-CRAMP是否具有直接抗ZIKV功能。首先，低于50μg/ml的LL37/CRAMP对于VeroE6细胞无影响。随后，以MOI=2的ZIKV感染VeroE6细胞，同时加入5-40μg/ml的CRAMP/LL-37，孵育2hr后洗去病毒，补加抗菌肽并培养至48hr，结果发现:cathelicidins能够剂量依赖性地抑制ZIKV在VeroE6细胞中的RNA、NS3蛋白和E蛋白的表达，20μg/mlCRAMP/LL37对病毒抑制效率超过90％，LL37效果优于CRAMP。提示抗菌肽cathelicidins在体外可直接高效抑制ZIKV感染复制活性。 4.CRAMP敲除小鼠体内ZIKV病毒复制水平显著增加且睾丸损伤和精子缺失显著加重 为明确体内抗菌肽cathelicidins对于包膜病毒ZIKV复制和急性睾丸炎的作用，以CRAMP敲除小鼠经尾静脉感染2×106PFU的ZIKV，检测睾丸病毒复制及睾丸病理，结果显示:感染第4天，CRAMP敲除小鼠的睾丸病毒RNA水平显著高于WT组(p＜0.01);睾丸病理分析表明:感染第16天，WT小鼠生殖细胞轻度退化，管腔内有空泡，而CRAMP敲除小鼠生殖细胞退化增多，生精小管内径增大，管腔内空泡明显增多，提示CRAMP抗菌肽可显著抑制体内病毒复制并保护病毒感染导致的睾丸损伤。 以1×103PFU的ZIKV直接睾丸内注射C57BL/6J小鼠，发现:同WT小鼠相比，CRAMP敲除小鼠睾丸缩小的症状显著加剧(p＜0.5)，感染至60天时，睾丸呈现透明，睾丸重量降至WT的50％，总精子数/活动精子数降至WT的20％(p＜0.001)，提示小鼠雄性生殖器官显著退化失能导致精子缺失;提示小鼠内源性CRAMP可保护ZIKV感染诱导的小鼠睾丸功能损害与不育。 5.抗菌肽cathelicidins抵御ZIKV病毒复制的机制探讨 1)cathelicidins以直接方式抑制了ZIKV的感染与复制特性 为了明确抗菌肽cathelicidins介导的ZIKV抑制机制，在ZIKV病毒感染同时，我们以20μg/mlCRAMP通过三种方式处理VeroE6细胞:①AMP-ZIKV-pre(ZIKV感染细胞前加CRAMP孵育2hr);②AMP-ZIKV-post(ZIKV感染细胞2hr后加入CRAMP);③AMP-ZIKV-co(ZIKV和CRAMP先共孵育2hr，一起加入细胞)。检测48hr后细胞内病毒水平。结果发现:无论是上清的病毒颗粒、还是ZIKV包膜蛋白E及非结构蛋白NS3的表达水平均在③ZIKV和CRAMP先共孵育2hr后再感染细胞的情况下非常显著地减少，病毒滴度从105降低至101TCID50/ml(p＜0.001)。抗菌肽能够直接结合ZIKV病毒颗粒;cathelicidins共孵育后的ZIKV基因组RNA由于失去包膜保护而以剂量依赖方式被RNase消化。提示:抗菌肽CRAMP直接作用于ZIKV显著抑制病毒的感染与复制。 2)抗菌肽cathelicidins通过抑制外泌体从而抑制ZIKV的感染与传播 病毒在感染细胞之后可能通过诱导细胞分泌含有病毒成分的细胞外囊泡(EV)方式实施体内感染与传播。为研究抗菌肽是否可能通过抑制外泌体方式抑制ZIKV，我们通过离心纯化方法，将来自正常细胞和ZIKV感染的VeroE6细胞培养上清的EV进行纳米颗粒跟踪分析(NTA)，结果发现:同对照组相比，ZIKV感染细胞上清的EV直径50-200nm，数量显著增多，且EV标志分子TSG101、CD63和Alix的表达显著增高。为了明确EV对ZIKV感染的影响及抗菌肽对EV的作用，ZIKV感染VeroE6细胞试验中，证实EV抑制剂GW4869处理细胞后可显著抑制ZIKV病毒滴度和蛋白NS3的表达，表明EV分泌可促进ZIKV的感染。而抗菌肽LL37和CRAMP均可显著抑制ZIKV诱导分泌至上清的EV生成(TSG101、CD63和Alix);免疫荧光证实抗菌肽在抑制EV形成同时能够显著抑制细胞中的ZIKV病毒E蛋白的表达。证实cathelicidin抑制ZIKV经由EV途径的胞间感染。 [结论] 综上，本课题首次在小鼠体内试验和细胞试验中，探索了进化保守的小分子抗菌肽Cathelicidins家族的鼠源CRAMP和人源LL-37对于包膜单股正链RNA病毒-Zika病毒的直接抗病毒作用，及其体内对ZIKV诱导的睾丸损伤及缺精不育的保护作用。我们证实:抗菌肽cathelicidins具有显著直接抵御包膜病毒-ZIKV的抗病毒作用;我们创新性发现抗菌肽cathelicidins通过两种机制抑制病毒复制:1)直接作用于病毒包膜的抗病毒机制;2)通过抑制ZIKV感染诱导的EV/外泌体分泌途径阻断病毒在细胞间的传播;使用CRAMP敲除小鼠，我们证实了CRAMP在体内能够显著抑制ZIKV复制及其诱导的急慢性睾丸损伤和精子减少。有关cathelicidins对ZIKV诱导EW外泌体分泌的抑制作用及其机制为首次报道，cathelicidin在体内保护ZIKV诱导的睾丸功能损伤作用也为首次报道。我们的创新性数据提示cathelicidin抗菌肽有望作为一种潜在的治疗ZIKV感染及寨卡病毒相关男性不育症新型的小分子多肽药物。
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