摘要
MIP(Major Intrinsic Protein)蛋白家族是一种广泛存在于植物中的通道蛋白。在大豆中，研究者已经发现了一个与固氮共生相关的MIP蛋白，并将它命名为nodulin-26。我们通过基因和蛋白序列的比对发现，在豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula )中，存在着与nodulin-26同源的基因Medtr8g087710(MIP8.1 )。同样，MIP8.1邻近的染色体位置上存在着另外一个同源基因Medtr8g087720(MIP8.2)。同时，通过从信号肽酶切复合体缺失的dnf1突变体中，提取突变体内质网上富集的蛋白，并与野生型内质网上富集的蛋白进行比较发现，与野生型相比MIP8.1在dnf1的内质网上大量富集。因此，MIP8.1和MIP8.2两个基因对蒺藜苜蓿固氮共生可能有着重要的调控作用。 利用在线数据库对这两个基因进行了基因表达量的分析，发现MIP8.1和MIP8.2都在根瘤中特异性表达。同时通过对其共表达基因的分析发现，MIP8.1和MIP8.2与很多的通道蛋白共表达，这说明了MIP8.1和MIP8.2与其它通道蛋白一起共同调控着共生体在植物细胞中的物质交换。 通过构建带有GFP标签的重组载体，并通过发根农杆菌Arqua1成功转入到植物根的细胞内，并鉴定到了转化的阳性根。在接种根瘤菌ABS7三周后，使用荧光共聚焦显微镜观察植物的根瘤组织发现：MIP8.1主要定位在细胞的共生体膜上。 通过构建带有GUS标签的重组载体，同样通过农杆菌Arqua1转入到了植物体内。在接种ABS7根瘤菌三周后，在进行GUS染色，在体视镜下观察，我们发现MIP8.1和MIP8.2主要在根瘤组织的固氮区和分生区中表达。 通过构建了用于拟南芥原生质体的双分子荧光互补的载体。在成功制备拟南芥原生质体后，我们将质粒转入到拟南芥原生质体中，计划观察MIP8.1与MIP8.2之间的蛋白互作的情况。 利用CRISPR技术，构建了CRISPR基因敲除载体，分别敲除了MIP8.1和MIP8.2这两个基因，但是都没有看到有明显的表型。所以我们计划同时敲除两个基因。另外，本课题也成功筛选得到了MIP8.1的逆转座子插入突变体。 共生体与植物细胞之间的物质交换对于固氮共生说至关重要，通过对MIP8.1与MIP8.2的功能进行分析与研究，将可以帮助揭示豆科植物固氮共生过程中，共生体与根瘤细胞之间进行信号和物质交换的机制。
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