摘要
清香型白酒是中国白酒具有代表性的香型之一，历史源远流长，文化底蕴深厚，主要香气成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯。酵母菌是酿酒过程中的主要微生物类群，能通过代谢产生酒精和乙酸乙酯。常见的产酯酵母在发酵后期的酒醅中却很难检测到，影响了清香白酒主体香成分乙酸乙酯的合成与积累。因此选育高产乙酸乙酯的酵母菌，对于提高乙酸乙酯含量，改善基酒品质有重要的作用。 本论文对22株清香白酒大曲及酒醅中分离的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行筛选，得到高产乙酸乙酯的S.cerevisiae，与相同来源分离到的异常威克汉逊酵母(Wickerhamomyces anomalus)进行耐酸耐乙醇比较，然后通过诱变处理选育高产乙酸乙酯的S.cerevisiae和W.anomalus，对得到的突变株进行固定化条件优化研究，最后应用于酿酒试验分析酒样的产酯量。主要结果如下： 1)S.cerevisiae是白酒酿造中主要的产酒和产乙酸乙酯的微生物，筛选高产乙酸乙酯的S.cerevisiae对于研究和提高白酒酒质有重要意义。本实验对22株S.cerevisiae进行高产乙酸乙酯菌株的筛选，由于乙酸乙酯是带有水果香味、易扩散的香气成分，因此在YPD固体培养基28℃培养48h后使用嗅闻法进行初筛，14株有水果香味，8株S.cerevisiae有酒精味。在液体发酵培养基中28℃培养48h后根据乙酸乙酯含量对14株有水果香味的S.cerevisiae进行复筛，结果S.cerevisiaeJ12-1的产酯能力最强，其酯含量0.68g/L，其次是S.cerevisiaeJ12-6、S.cerevisiaeJ10-4，酯含量分别为0.59g/L、0.57g/L。 2)W.anomalus是常见的产酯微生物，在酿造过程中经过短时期发酵后，生长受到抑制并慢慢被酿酒酵母所取代。为了分析白酒发酵后期W.anomalus生长受抑制的原因，本实验将S.cerevisiaeJ12-1与W.anomalusJ2-5接种到不同酒精浓度以及不同pH的发酵培养基中，28℃静置培养6d，定期检测OD600的菌体浓度，比较W.anomalusJ2-5和S.cerevisiaeJ12-1对酒精和酸的耐受性。耐酸性实验结果发现随着发酵时间的增加和发酵液pH的降低，S.cerevisiaeJ12-1菌体浓度整体呈下降的状态，而W.anomalusJ2-5在pH为3.6培养6d时OD值为4.81，生长较好说明受pH影响较小。但在酒精耐受性实验中，W.anomalusJ2-5耐酒精较差，12%酒精浓度条件下培养6d后，与培养相同时间的其他酒精浓度条件相比其菌体浓度最低，OD值为3.09。 3)在白酒发酵后期随着酒醅乙醇和总酸等代谢产物的增加，使酵母菌的生长受到抑制，使得酒样中乙酸乙酯的量很难提高。为了获得高产乙酸乙酯，耐酸耐乙醇能力较好的酵母菌株，本实验分别以W.anomalusJ2-5为出发菌株经254nm的紫外线照射150s、微波照射35s复合诱变后，和以S.cerevisiaeJ12-1为出发菌株经254nm的紫外线照射240s、微波照射35s复合诱变后，在添加乙酸乙酯和溴甲酚紫指示剂的初筛培养基中培养2d，依据透明圈(D)/菌落(d)的比值初筛，结果发现突变株W.anomalusY5-5的D/d值是出发菌株的1.96倍，而突变株S.cerevisiaeZ3-3的D/d值为8.67，是出发菌株的3.85倍。并利用皂化法测定其乙酸乙酯产量复筛，并及接种到不同酒精浓度和不同pH的YPD液体培养基中进行耐受性测定。最终选育到产酯量高、耐酒精、耐酸能力强而且遗传稳定性好的突变株是W.anomalusY5-5和S.cerevisiaeZ3-3，酯产量分别达到3.75g/L和2.68g/L。 4)W.anomalusY5-5在酯产量和酒精耐受性等方面优于S.cerevisiaeZ3-3等突变株，而乙醇对W.anomalusY5-5生长和发酵性能具有严重抑制作用，为了增加稳定产酯酵母的活性，提高酿造过程的酯含量，本实验首先通过单因素和正交试验优化W.anomalusY5-5的固定化条件，然后分析比较了固定化W.anomalusY5-5对酿酒过程的影响。结果表明，海藻酸钠浓度3%，氯化钙浓度2.0mol/L，固定化温度25℃，包埋菌液量109个/mL固定化W.anomalusY5-5效果最好。将其应用于模拟酿酒试验后，串蒸酒样在总酸、酒精度和pH与只加大曲的对照组无显著差异的条件下，酯含量高达3.4g/L，比对照组提高了1倍左右。
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