摘要
目的：锁阳是我国传统补肾阳中药，具有补肾填精，生津润燥等功效，能够增强性功能和免疫力，有一定抗骨质疏松的作用，广泛应用于治疗男科、妇科及老年性骨质疏松等疾病。成骨细胞主要负责骨生成，是维持体内骨平衡的重要细胞成分之一。其中，对成骨细胞分化的正向调控对骨稳态有重要的意义。成骨分化受到多条信号通路、多种因子共同调控。本实验在中医“肾主骨生髓”理论指导下，选用常用补肾中药锁阳制备不同浓度的含药血清，基于Wnt/β-catenin信号通路初步探讨锁阳含药血清对成骨分化的影响及在成骨过程中可能的分子作用机制，丰富中医“肾主骨生髓”理论的科学内涵，促进锁阳资源的开发应用，并指导临床用药。 方法：本实验选取SPF级昆明小鼠，设立对照组和高、中、低剂量组，用不同浓度的锁阳水煎液(对照组用生理盐水代替)灌胃后制备相应不同浓度锁阳含药血清干预体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞，用CCK-8法检测细胞增殖情况、钙钴法染色检测细胞分泌碱性磷酸酶(ALP)能力、茜素红染色法检测成骨细胞钙化情况，实时荧光定量PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路成骨相关基因β-catenin、Runx2、Osterix(OSX)mRNA的表达水平，酶联免疫吸附(ELISA)法检测基质细胞衍生因子-1(SDF-1)分泌水平。 结果： 1．在24h、48h、72h三个时间点，与对照组比较，锁阳含药血清各剂量组对小鼠MC3T3-E1细胞的增殖均有促进作用，且有一定剂量相关性，同一时间点的细胞增殖能力高剂量组＞中剂量组＞低剂量组。24h时，与对照组比较，锁阳含药血清各剂量组促细胞增殖能力均有显著提高(p＜0.01)；48h和72h时，低剂量组与对照组比较，差异不具有统计学意义(p＞0.05)；中剂量组和高剂量组与对照组比较，细胞均有显著增殖(p＜0.01)；与低剂量组比较，中剂量组不具有统计学意义(p＞0.05)，高剂量组具有显著性差异(p＜0.01)。 2．与对照组比较，锁阳含药血清各剂量组均能显著促进小鼠MC3T3-E1细胞分泌ALP，差异有统计学意义(p＜0.05)，且随着锁阳含药血清浓度增加，ALP分泌亦增加，呈剂量依赖性，中剂量组与高剂量组作用更为显著(p＜0.01)。 3．与对照组比较，锁阳含药血清各剂量组均能显著促进MC3T3-E1细胞钙化，差异有统计学意义(p＜0.05)，且矿化结节面积与锁阳含药血清浓度间呈剂量依赖性，含药血清浓度越高，矿化结节数越多，面积越大。 4．与对照组比较，锁阳含药血清中、高剂量组均能够显著促进小鼠MC3T3-E1细胞分泌SDF-1(p＜0.01)。与低剂量组比较，高剂量组促SDF-1分泌水平有统计学差异(p＜0.05)。 5．与对照组比较，锁阳含药血清各剂量组均能不同程度促进小鼠MC3T3-E1细胞β-catenin、Runx2、OSXmRNA的表达。其中，高剂量组能促进β-cateninmRNA的表达且有统计学差异(p＜0.05)，低、中剂量组不具有统计学意义(p＞0.05)。锁阳含药血清各剂量组对小鼠MC3T3-E1细胞Runx2、OSXmRNA的表达均有一定的促进作用，其中高剂量组能够显著促进Runx2、OSXmRNA的表达(p＜0.01)，低、中剂量组不具有统计学差异(p＞0.05)。且具有一定的剂量依赖性，在一定浓度范围内，浓度越高，促进作用越明显。结论：本实验研究结果表明： 1.锁阳含药血清能够促进小鼠MC3T3-E1细胞的前期增殖，表现为时间一剂量依赖性，在72小时内，干预时间越长，细胞增殖越明显。 2．ALP和矿化结节是成骨分化的显著标志。锁阳含药血清干预7天后，ALP的表达水平呈剂量依赖性增多；干预14天后，其药物各组细胞的矿化结节也明显表现为剂量依赖性增加；说明锁阳含药血清具有显著促进小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化的作用。 3．Wnt/β-catenin信号通路是成骨分化的主要途径之一。锁阳含药血清能以浓度依赖性方式促进Wnt/β-catenin信号通路中促成骨分化关键基因p-catenin、Runx2、OSXmRNA的表达上调，说明锁阳含药血清促成骨分化的作用机制与Wnt/β-catenin信号通路有关。 4．基质细胞衍生因子1(SDF-1)能通过BMP2调控成骨分化关键基因Runx2等的表达，并与Wnt/β-catenin信号通路相互作用，共同调控成骨分化。锁阳含药血清能以浓度依赖性方式明显促进小鼠MC3T3-E1细胞分泌SDF-1，说明其促成骨分化的作用可能还和SDF-1的分泌有关。 5．本实验表明，锁阳含药血清对小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化有明显的促进作用，可能与以下两个环节有关：第一，通过Wnt/β-catenin信号通路上调成骨分化过程中的关键基因的表达，促进成骨分化。第二，促进小鼠MC3T3-E1细胞分泌SDF-1，参与成骨分化。且Wnt/β-catenin信号通路与SDF-1可能通过BMP2发挥协同作用，但其机制有待进一步研究。
NETL