摘要
无脊椎动物缺乏适应性免疫，其只能依靠先天免疫系统来抵抗病原微生物的入侵。无脊椎动物通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别位于微生物表面的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)，进而产生相应的免疫应答反应。近年来，随着虾蟹人工养殖规模的不断扩大，多种细菌、真菌和病原性疾病的爆发对甲壳动物养殖业造成了巨大的经济损失，所以进一步了解宿主与病原的关系，尤其是免疫相关基因对病原的免疫应答机制，对甲壳动物疾病的防治有着深远的意义，同时也有助于丰富甲壳动物先天免疫理论知识。本研究以克氏原螯虾和拟穴青蟹为实验材料，研究甘露糖受体(mannose receptor, MR)和脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharideandβ-1,3-glucanbindingprotein,LGBP)的性质，得到了以下结果： 一、克氏原螯虾甘露糖受体基因(PcMR)的克隆与功能研究 甘露糖受体，是一种重要的模式识别受体，也是甲壳动物中发现的第一个跨膜C-型凝集素家族成员，其在先天免疫应答中发挥着重要的作用。MRs的功能在一些哺乳动物和硬骨鱼类中已有报道，但在无脊椎动物中，目前尚无任何关于该受体功能的报道。本研究中，我们在克氏原螯虾的肝胰腺中克隆到甘露糖受体基因，通过生物信息学分析后发现它的cDNA全长6848bp，其中开放阅读框(opening read frame, ORF)为6288bp，编码2095个氨基酸(amino acid, aa)，包括含有由31个aa组成的信号肽。PcMR主要分布在肝胰腺和血细胞中，并且在鳗弧菌刺激后呈上调表达。PcMR含有14个C-型凝集素结构域(C-type lectin domain, CTLD)。为了研究PcMR的生物学功能和潜在的抗菌机制，我们将其分为四段，命名为CTLD1–3，CTLD4–6，CTLD7–10，CTLD11–14，分别进行过表达和蛋白纯化。综合细菌结合实验和微生物多糖结合实验的结果，可以得出：CTLD1–3，CTLD4–6，CTLD7–10，CTLD11–14对这些微生物具有广泛的结合能力，对微生物表面的多糖也表现出不同的结合强度。此外，凝集实验结果表明：CTLD1–3，CTLD4–6，CTLD7–10，CTLD11–14在Ca2+的作用下，可促使细菌的凝集。细菌清除实验结果表明，按摩尔比混合的四种重组蛋白可以有效地促进细菌的清除。通过siRNA干扰PcMR沉默后的清除实验，也进一步验证了PcMR具有一定的抗细菌活性。综上所述，本研究从克氏原螯虾中鉴定了一个甘露糖受体的同源分子，且其具有一定的抗细菌活性，该研究为理解无脊椎动物中甘露糖受体的功能提供了新的视角。 二、拟穴青蟹脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白基因(SpLGBP)的克隆及功能研究 根据转录组测序结果，设计特异性引物从拟穴青蟹的肝胰腺中克隆到了LGBP基因。SpLGBP的cDNNA长度为1217bp，其中ORF区为1195bp，编码364个aa，包括含有由31个aa组成的信号肽。SpLGBP蛋白分子量约为39.9kDa，其理论等电点为4.53。提取正常拟穴青蟹的血细胞、肝胰腺、鳃、肠、胃、结缔、肌肉中的总RNA，经转录后作为模板，进行定量PCR检测。结果表明，SpLGBP基因在我们所检测的组织中均有表达，但主要在肝胰腺中表达。经副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌分别刺激拟穴青蟹后发现，SpLGBP在刺激后的第6h和第12h均呈现上调表达趋势。我们将SpLGBP在大肠杆菌系统中进行过表达并将重组蛋白纯化，利用重组蛋白SpLGBP(rSpLGBP)进行了细菌结合实验、微生物多糖结合实验、凝集实验、RNA干扰实验和检测抗菌肽的表达情况等来研究其抗菌功能。此外，我们还探究了rSpLGBP对酚氧化酶活性是否有影响，实验结果表明rSpLGBP可能与LPS结合来提高酚氧化酶活性。
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