摘要
砷是一种自然界广泛存在的类金属，是常见的环境与职业有害因素，在饮用水中即使含量低于规定标准也具有有害作用。长期暴露于砷会引起肺、肝、膀胱和皮肤等器官的癌变以及心血管疾病、糖尿病和黑脚病等非癌性病变。有关砷暴露致癌的机制有多种假说，目前有研究显示，环状RNA(circular RNAs， circRNAs)和外泌体在亚砷酸钠(sodium arsenite，NaAsO2)所致肝细胞恶性转化以及肝癌的进程中发挥重要作用，但其具体作用中的分子机制尚未明确，有待进一步研究。 circRNAs是一类新近发现的具有闭合环状结构的非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)。多种circRNAs已被证实可作为肝癌发生发展的潜在标志物并发挥“微小RNA(microRNAs，miRNAs)海绵”的作用。外泌体是一类细胞衍生的囊泡，存在于血液、尿液和细胞培养液等多种液体介质中，通过与周围细胞以及远端细胞融合并释放其内容物，从而介导细胞间通讯，在肿瘤微环境中发挥重要作用。最近有研究显示circRNAs在外泌体中也有较高的表达丰度，circRNAs在亚砷酸钠致癌中也发挥重要作用，然而外泌体circRNAs在亚砷酸钠所致肝癌中的作用未见报道。 因此，本课题在前期建立的长期暴露于NaAsO2引起人肝(L-02)细胞发生恶性转化的细胞模型基础上，运用多种分子生物学技术手段，探讨外泌体circRNA_100284在NaAsO2所致L-02细胞周期紊乱和异常增殖及其恶性转化中的作用及部分分子机制，并在不同水平砷暴露人群中检测血清外泌体外泌体circRNA_100284水平。进而为阐明砷化物的致癌部分机制，并为建立快速、准确、敏感的砷暴露致肝癌筛检系统提供一定的科学依据。 目的 探讨外泌体circRNA_100284调控miRNA-217在亚砷酸钠所致人肝L-02细胞周期改变与异常增殖及其恶性转化中的作用及分子机制。 方法 分别用0.0或2.0μMNaAsO2急性处理L-02细胞0、3、6、12或24h，或者慢性处理L-02细胞0、10、20或30代，接着分别用2.0μMNaAsO2持续处理30代的恶性转化肝L-02细胞(T-L-02)培养液(T-CM)或T-CM中提取的外泌体(T-CM-exo)处理正常L-02细胞或尚未发生恶性转化的L-02细胞；通过circRNA_100284siRNA处理下调T-L-02细胞及其分泌的外泌体circRNA_100284水平，或pLCDH-circRNA_100284质粒处理上调2.0μMNaAsO2持续处理20代L-02(As-L-02-p20)细胞circRNA_100284水平；通过miRNA-217mimic处理上调L-02细胞miR-217水平，或miR-217inhibitor处理下调L-02细胞miR-217水平。 qRT-PCR检测circRNA_100284水平，Westernblot检测EZH2与cyclin-D1蛋白水平；流式细胞分析术检测细胞周期改变；CCK8检测细胞增殖水平；软琼脂集落形成实验与裸鼠皮下致瘤实验检测细胞恶性程度；Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力；应用生物信息学工具预测与circRNA_100284结合的miRNA；瞬时转染技术探讨外泌体circRNA_100284通过miR-217调控EZH2在T-L-02细胞促进正常L-02细胞周期加快和异常增殖中的作用；提取正常人群和不同水平砷暴露人群血清外泌体，用qRT-PCR技术检测circRNA_100284水平。 结果 1、circRNA_100284在亚砷酸钠所致L-02细胞恶性转化中的作用 (1)亚砷酸钠暴露对L-02细胞恶性程度以及circRNA_100284水平的影响 结果发现2.0μMNaAsO2连续处理肝L-02细胞30代后，与同代数对照细胞相比，长期暴露于NaAsO2显著增强了L-02细胞在软琼脂上形成集落的能力以及在裸鼠皮下形成肿瘤的能力。2.0μMNaAsO2急性处理6h或慢性处理10代后，相比于处理前或同代对照细胞，L-02细胞circRNA_100284水平显著升高，并随处理时间延长而逐渐升高，具有一定时间-效应关系。RNaseR处理T-L-02细胞后，与其线性母基因谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCLM)相比，circRNA_100284可以抵抗RNaseR的降解消化作用，而利用细胞核和细胞质分离技术分别提取T-L-02细胞核和细胞质中的RNA后发现circRNA_100284在细胞质中表达水平显著高于细胞核。说明长期暴露于2.0μMNaAsO2可引起L-02细胞发生恶性转化，并引起circRNA_100284表达水平升高。 (2)circRNA_100284在亚砷酸钠所致L-02细胞恶性转化中的作用 结果发现下调T-L-02细胞circRNA_100284水平可抑制T-L-02细胞在软琼脂上形成集落的能力以及迁移侵袭能力；使用pLCDH-circRNA_100284质粒处理尚未发生恶性转化的持续暴露于NaAsO220代的L-02细胞(As-L-02-p20)后，As-L-02-p20细胞circRNA_100284水平上升的同时，在软琼脂上形成集落的能力以及迁移侵袭能力也显著增强。说明长期暴露亚砷酸钠可引起L-02细胞发生恶性转化，且circRNA_100284在亚砷酸钠诱导L-02细胞恶性转化中发挥重要作用。 2、T-L-02细胞培养液对正常肝L-02细胞circRNA_100284水平以及细胞周期和细胞增殖的影响 结果发现与同代数对照细胞培养液(CM)相比，T-L-02细胞培养液(T-CM)处理的正常L-02细胞circRNA_100284以及EZH2和cyclinD1表达水平显著升高，且细胞从G1期向S期跃迁显著加快，以及细胞增殖率显著升高。说明亚砷酸钠所致恶性转化L-02细胞的培养液可以引起正常L-02细胞circRNA_100284水平升高以及细胞周期紊乱和异常增殖。 3、阻滞外泌体形成对T-L-02细胞培养液升高正常L-02细胞circRNA_100284水平以及细胞周期和增殖的影响 结果发现在使用外泌体合成抑制剂GW4869处理T-L-02细胞后，其培养液引起正常L-02细胞circRNA_100284以及EZH2和cyclinD1表达水平相对于对照T-L-02细胞培养液处理组显著降低，细胞周期阻滞也被拮抗。说明亚砷酸钠所致恶性转化L-02细胞的培养液通过外泌体影响正常L-02细胞circRNA_100284表达以及周期进程。 4、T-L-02细胞分泌的外泌体对正常L-02细胞circRNA_100284水平的影响 结果发现从正常L-02(C-L-02)细胞和T-L-02细胞中提取的外泌体(CM-exo和T-CM-exo)均呈现直径集中在100nm左右的盘状结构，且均有外泌体典型标记蛋白的表达。T-CM-exo中circRNA_100284水平明显高于CM-exo，且能被正常L-02细胞有效摄入，引起正常L-02细胞中circRNA_100284水平显著升高。说明NaAsO2所致恶性转化L-02细胞分泌的外泌体可携带circRNA_100284并被正常L-02细胞所摄入。 5、T-L-02分泌的外泌体对正常L-02细胞周期和细胞增殖的影响 结果发现T-CM-exo处理明显引起正常L-02细胞EZH2和cyclinD1表达水平显著升高，且随外泌体处理剂量升高呈剂量-效应关系，同时引起正常L-02细胞从G1期向S期跃迁显著加快，细胞相对增殖率显著升高。说明提取自NaAsO2所致恶性转化L-02细胞的外泌体可以引起正常L-02细胞周期紊乱以及异常增殖。 6、circRNA_100284在T-L-02细胞分泌的外泌体引起正常L-02细胞周期紊乱和异常增殖中的作用 结果发现在下调T-CM-exo中circRNA_100284表达水平后，可拮抗T-CM-exo诱导的正常L-02中circRNA_100284、EZH2和cyclinD1蛋白水平表达升高，且引起细胞周期有所阻滞，说明亚砷酸钠所致恶性转化L-02细胞分泌的外泌体circRNA_100284在亚砷酸钠所致正常L-02细胞周期紊乱和异常增殖中发挥重要作用。 7、T-L-02细胞分泌的外泌体circRNA_100284调控miR-217对正常肝L-02细胞周期与增殖的影响 结果发现circRNA_100284与miR-217存在碱基序列互补配对结合位点，在正常L-02细胞中上调miR-217水平可以阻滞T-CM-exo引起的EZH2和cyclinD1表达水平升高的作用，相比于单独下调circRNA_100284水平的T-CM-exo处理组，下调circRNA_100284水平的T-CM-exo与下调miR-217联合处理的L-02细胞EZH2和cyclinD1表达水平显著回升，阻滞的细胞周期也得以恢复，并且相对细胞增殖水平也显著升高。说明亚砷酸钠所致恶性转化L-02细胞分泌的外泌体circRNA_100284调控miR-217引起正常肝L-02细胞周期紊乱与异常增殖。 8、circRNA_100284在T-L-02细胞分泌的外泌体引起正常L-02细胞周期紊乱和异常增殖及其恶性转化中的作用 结果发现在下调T-CM-exo中circRNA_100284表达水平后，阻滞了T-CM-exo诱导的未发生恶性转化的L-02细胞的集落形成能力、裸鼠皮下致瘤能力以及迁徙侵袭能力的增强。说明亚砷酸钠所致恶性转化L-02细胞分泌的外泌体circRNA_100284在亚砷酸钠所致L-02细胞恶性转化中发挥重要作用。 9、砷暴露人群中血清外泌体circRNA_100284水平变化 结果发现在砷暴露人群血清外泌体中circRNA_100284表达水平显著高于对照人群。说明血清外泌体circRNA_100284可作为砷暴露的潜在生物标志物。 结论 1.circRNA_100284在亚砷酸钠慢性处理所致肝细胞发生恶性转化中发挥重要作用，并能通过外泌体转运至正常肝细胞； 2.亚砷酸钠所致恶性转化肝细胞外泌体circRNA_100284调控miR-217引起正常肝细胞发生周期紊乱和异常增殖，从而参与亚砷酸钠所致肝细胞恶性转化中发挥重要作用。 3.砷暴露人群血清外泌体中circRNA_100284显著升高。
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