摘要
研究目的及背景: 卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，浆液性卵巢癌(SOC)占卵巢上皮癌绝大部分，其中高级别浆液性癌，恶性程度较高，预后较差。卵巢癌患者经治疗后，往往存在化疗复发、多重耐药的情况。因此，研究卵巢癌发病机制，发现早期监测指标尤为重要，可以为进一步指导临床治疗打下基础。 CYC1(Cytochrome c-1)是线粒体复合体Ⅲ的重要亚单位，在生物氧化过程中，可发生组织氧化还原的迅速酶促作用。CYC1在乳腺导管原位癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤和骨肉瘤等癌症中均高表达。CYC1可参与线粒体依赖的凋亡途径，抑制AMPK的活化，促进肿瘤的增殖转移。 本研究通过基因表达谱测序和蛋白质谱检测技术，发现浆液性卵巢癌中CYC1表达明显高于输卵管伞，利用组织芯片TMA发现CYC1高表达与卵巢癌的不良预后相关。通过一系列的功能实验验证CYC1的功能，发现其在SOC中发挥促肿瘤浸润转移、增殖、调控细胞周期和化疗耐药作用。同时通过高通量测序技术，发掘了CYC1的发挥功能下游分子机制，探讨了其潜在结合的分子及相关信号通路。 研究方法: 1.收集正常输卵管伞(FT)及浆液性卵巢癌(SOC)组织，RT-qPCR和WesternBlot检测组织中CYC1表达。对组织芯片(3张)免疫组化染色，统计CYC1的表达与预后关系。 2.构建CYC1过表达及降表达的稳定细胞系。以MTT法检测细胞增殖能力，Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移能力，流式细胞术检测细胞周期进程，WesternBlot检测细胞周期及EMT相关蛋白。 3.对细胞进行一定浓度梯度的顺铂、奥拉帕尼刺激，检测CYC1蛋白表达量，MTT法测细胞增殖能力，平板克隆验证细胞的长期增殖能力。TUNEL法与流式细胞术结合，检测CYC1对细胞凋亡的影响。 4.RNA-seq法寻找CYC1发挥功能的下游分子机制，对丰度较高的基因进行WesternBlot及RT-qPCR验证。 研究结果: 1.CYC1在SOC中mRNA及蛋白表达明显高于输卵管伞，TCGA数据集分析发现CYC1在的SOC中存在异常拷贝数扩增，拷贝数的扩增与CYC1的蛋白和mRNA的表达相关。 2.通过免疫组织化学分析TMA中CYC1的表达水平，CYC1高表达患者总生存期短，CYC1高表达与SOC的不良预后相关。 3.CYC1增强SOC细胞的增殖能力，通过MTT生长曲线及平板克隆实验，证明过表达CYC1促进细胞增殖，干扰CYC1后抑制细胞增殖。降表达CYC1阻滞细胞在G1→S期，CYC1过表达则引起G0/G1期向S期转化。干扰CYC1后，抑制周期相关蛋白CCNB1、CCNE1、CDKs表达，而促进p21，p27依赖性激酶抑制剂蛋白。 4.CYC1促进浆液性卵巢癌细胞的侵袭迁移能力，降表达CYC1，减弱HO8910细胞和A2780细胞的侵袭、迁移能力，过表达促进细胞的侵袭、迁移能力。干扰CYC1后，上皮性蛋白标志物表达升高，间质性蛋白标志物表达降低，EMT相应转录因子MMP9、Snail、Slug表达均降低。 5.CYC1的高表达促进人卵巢癌皮下移植瘤生长，CYC1过表达组瘤体平均重量显著高于对照组，免疫组化染色表明CYC1过表达组中细胞增殖标记物Ki-67表达增加。 6.CYC1促进SOC化疗耐药，顺铂处理明显提高CYC1蛋白表达水平，耐药MTT实验显示过表达CYC1，促进A2780、SKOV3和HO8910细胞增殖;平板克隆实验显示，干扰CYC1降低细胞长期生长活力。降表达CYC1后，凋亡相关蛋白表达增高，早期及晚期凋亡细胞增加，说明CYC1通过抑制凋亡发挥耐药作用。 7.沉默CYC1增敏奥拉帕尼对BRCA野生型卵巢癌细胞作用，在SKOV3和A2780细胞中，奥拉帕尼处理条件下，降表达CYC1明显降低细胞存活率。 8.RNA-Seq测序结果显示，CYC1调控多种重要通路下游分子表达。RT-qPCR结果表明，A2780细胞中干扰CYC1后，CCNE2和BIRC3表达显著下降，此外，FGF18、EGFR、WNT5B、NFKBIA和FZD4表达均有下降。WesternBlot表明降表达CYC1后，CCNE2和BIRC3蛋白表达量降低。 研究结论: 1.CYC1在浆液性卵巢癌中表达明显高于输卵管伞，与SOC不良预后相关。 2.CYC1作为卵巢癌不良预后因子，促进浆液性卵巢癌的恶性生物学行为，是卵巢癌潜在治疗靶点。 3.CYC1促进SOC对化疗耐药，降表达CYC1可以增加化疗作用敏感性。 4.CYC1通过调控CCNE2和BIRC3等多种重要分子发挥促癌作用。
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