摘要
猕猴桃细菌性溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae，Psa）引起的细菌性病害，对世界范围内猕猴桃产业造成了巨大的经济损失。Psa菌株体内含有许多毒力因子，其中Ⅲ型效应蛋白是病原菌致病的关键因子。目前在Psa菌株的基因组中共发现51个Ⅲ型效应蛋白，而其中Ⅲ型效应蛋白HopZ5是毒力最强的Psa3菌株所特有的。本研究拟通过鉴定出效应蛋白HopZ5在猕猴桃中的靶蛋白，解析HopZ5的致病机制。 目前，已有研究表明HopZ5在烟草细胞中瞬时表达时定位于细胞质膜上。首先，本研究以易感染溃疡病的‘红阳’猕猴桃为实验材料构建膜蛋白cDNA文库，并对文库质量进行检测。结果显示构建的cDNA文库滴度为3.68×109cfu/mL;插入片段大小在500-1000bp之间。本研究所构建的cDNA文库符合要求，可用于酵母双杂交实验。 接下来，利用构建好的cDNA文库进行酵母双杂交实验，经过初步筛选和在NCBI数据库和猕猴桃信息资源库(Kiwifruit Information Resource，KIR)进行序列比对，共获得17个与HopZ5互作的阳性克隆。为了进一步验证HopZ5与候选蛋白的互作关系，我们构建了pGBKT7-HopZ5诱饵蛋白载体，同时将候选蛋白构建到猎物载体pGADT7上，通过点对点酵母双杂交实验，最终得到4个可能与HopZ5存在互作关系的蛋白，Ach00g025281(DUF4228)、Ach00g374801(Esterase)、Ach25g374161(RBCS1)、Ach03g239841(LWD1)。随后，我们对筛选到的候选蛋白做了亚细胞定位分析，结果显示候选蛋白Ach00g025281，Ach00g374801，Ach03g239841均定位在细胞质膜上，而Ach25g374161定位在叶绿体上。 综上所述，利用酵母双杂交系统从‘红阳’猕猴桃cDNA文库中筛选HopZ5的互作蛋白，获得17个候选蛋白。利用酵母双杂交实验对这些蛋白进行进一步验证，结果显示其中4个候选蛋白可能与HopZ5之间存在互作关系。另外，亚细胞定位分析结果显示，除了Ach25g374161定位在叶绿体上，其他三个候选蛋白均定位在细胞质膜上。后续我们以这四个候选蛋白为重点研究对象，利用BiFC、Co-IP、Pull Down等方法进一步验证和分析，并结合转录组和乙酰化修饰组学，解析效应蛋白HopZ5的致病机理。
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