摘要
在海洋环境中，节肢动物藤壶通过生产、分泌和固化粘性多蛋白复合物（藤壶胶），获得了永久附着在各种水下基质的独特能力。目前，藤壶胶作为新型高强度生物粘合剂在生物医药领域具有重要应用价值。虽然对藤壶胶的组成特征、结构与理化特性、合成和分泌的特点、粘附固化机制有了一些了解，但由于其溶解性差、分泌过程复杂等特点，导致对藤壶胶蛋白结构和功能的研究尚有待进一步深入。Cp19k蛋白是藤壶胶复合物中的主要成分之一，其在藤壶粘附过程中主要起界面粘附的作用，本研究通过基因工程技术实现了 Cp19k蛋白在在大肠杆菌中的可溶性表达，纯化制备了重组 Cp19k蛋白，并初步探究了其粘附能力。具体研究内容如下： 第一部分：Cp19k蛋白表达纯化及影响因素分析。利用 Gene Bank数据库查找balcp19k、mrcp19k和bicp19k基因序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性和GC含量对三个基因序列进行了优化，将优化序列送公司合成。同时构建了重组表达质粒pET21a-balcp19k、pET21a-mrcp19k和 pET21a-bicp19k，重组质粒转入大肠杆菌 BL21（DE3），不同条件诱导表达，结果发现 mrcp19k和 bicp19k基因无目的蛋白表达， Balcp19k蛋白成功表达。我们对Mrcp19k蛋白和Bicp19k蛋白不表达的因素进行分析，排除了密码子偏性和表达条件的影响因素后，对三个 cp19k基因的 mRNA二级结构分析发现mrcp19k和bicp19k基因5′端二级结构过于稳定是导致蛋白不表达的主要因素。通过对Balcp19k蛋白表达条件的优化，最终确定当诱导温度为27℃、诱导剂 IPTG浓度为1.0mM、诱导时间为4h时，可溶性Balcpk蛋白的表达量最高。重组蛋白通过亲和层析和分子筛层析纯化后获得了纯度约为92.5%的Balcp19k蛋白。 第二部分：Balcp19k蛋白鉴定和粘性检测。将纯化后的 Balcp19k蛋白进行质谱鉴定，鉴定结果显示表达和纯化的蛋白为Balcp19k蛋白。圆二色谱测定结果显示Balcp19k蛋白的二级结构主要以β-折叠结构为主，与文献报道情况一致。CBB染色表面涂层分析实验表明，Balcp19k蛋白在疏水性材料和亲水性材料表面均具有界面黏附作用， Balcp19k蛋白和Cell-TakTM合用后的粘附能力大于Cell-TakTM，具体粘附机制还有待进一步深入研究。 综上所述，本研究成功建立了Cp19k蛋白原核表达体系，成功制备了可溶性的重组Balcp19k蛋白，并对其界面粘附能力进行了初步探究。研究结果为其他藤壶胶蛋白的研究提供借鉴，也为生物医用粘附材料的研究提供参考。
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