摘要
目的： 细菌由浮游状态向生物膜状态的转变是细菌应对外界环境改变的有效策略，生物膜的形成受多种因素调节，sRNA在其中发挥重要作用。伤寒沙门菌（Salmonella enterica serotype Typhi,S.Typhi）是一种重要的人类肠道致病菌，也是典型的原核基因表达调控研究的模式菌。本课题组前期利用高通量测序技术对浮游及生物膜两种状态下的S.Typhi野生株进行转录组测序，发现多个差异表达的sRNA。其中一个假定sRNA S305在浮游菌中的表达丰度明显高于生物膜细菌。本论文旨在对假定sRNA S305进行分子鉴定，并探究其不同时期的表达特性，在S.Typhi的生物膜形成和动力中的作用及机制研究。 方法： 1.分子鉴定：（1）表达确认：设计特异性探针，利用northern blot技术检测S.Typhi野生株中sRNA S305的表达，初步验证S305的存在表达。（2）全长鉴定：分别利用5'RACE和3'RACE检测S305在基因组上的起始位点和终止位点，确定其基因位置和序列全长。 2.不同时期表达特征分析：分别提取S.Typhi野生株不同生长时期（迟缓期、对数中期、对数晚期和稳态期）的总RNA，利用northern blot技术检测S305在各个生长时期的表达水平。 3.高表达菌株构建：根据S305全长序列信息设计特异性引物，利用质粒pBAD/HisA构建S305高表达载体pBAD-pS305，并将阳性重组质粒及空质粒电转入S.Typhi野生株中，制备高表达菌株WT-pS305及空质粒对照株WT-pBAD。 4.各菌株表型分析：根据实验所需，分别将WT-pS305及WT-pBAD菌株培养至相应条件，进行生物膜形成实验（96孔微量板结晶紫染色法）、细菌泳动实验并绘制生长曲线。 5.作用机制分析：（1）通过qRT-PCR分析WT-pS305及WT-pBAD菌株中鞭毛和生物膜形成相关基因的mRNA水平。（2）分别提取WT-pS305和WT-pBAD在利福平处理后第0min、4min、8min、16min、32min的总RNA，利用qRT-PCR和northern blot检测各组中csgD及fljB的mRNA含量，并计算相应mRNA的半衰期。（3）利用质粒pBAD/HisA构建带有S305不同片段长度的高表达载体，并电转入S.Typhi野生株，分别制备高表达菌株WT-pS305-q60、WT-pS305-q120、WT-pS305-q180、WT-pS305-q240、WT-pS305-q300、WT-pS305-q360、WT-pS305-q420；并利用qRT-PCR检测各菌株中fljB和csgD的mRNA水平。（4）利用RNAfold等网站对S.Typhi中S305的潜在靶基因进行预测，并利用qRT-PCR检测部分预测靶基因的mRNA水平。 结果： 1.Northern blot分析结果证实S305在S.Typhi中存在表达，其可能来源于阻遏蛋白编码基因cI的3'UTR；5'RACE结果显示S305的起始位点位于cI终止密码子上游99nt处，3'RACE结果显示S305的终止位点位于cI终止密码子下游396nt处。 2.qRT-PCR及northern blot分析结果表明，S305的表达水平随生长时期呈动态变化，在对数中期和平台期表达丰度较高，在迟缓期和对数晚期表达丰度较低；全长转录本则随生长逐渐减少。 3.表型分析结果显示，WT-pS305的生物膜形成能力及泳动能力均明显低于WT-pBAD；普通培养条件下，在进入对数期后WT-pS305的生长速率明显缓于WT-pBAD。 4.qRT-PCR分析结果显示，WT-pS305中fljB、csgD的mRNA水平均明显低于WT-pBAD，csgA和bcsA的mRNA水平较WT-pBAD中轻微下降；半衰期检测发现，WT-pS305中fljB mRNA的降解速率明显大于WT-pBAD,WT-pBAD中fljB的mRNA半衰期约25min而WT-pS305中则缩短至约15min。 5.成功制备高表达菌株WT-pS305-q60、WT-pS305-q120、WT-pS305-q180、WT-pS305-q240、WT-pS305-q300、WT-pS305-q360、WT-pS305-q420。qRT-PCR结果显示与WT-pBAD相比，WT-pS305-q420中fljB的mRNA水平均明显下降，而其它高表达菌株中则无显著差异。与WT-pBAD相比，WT-pS305-q60~WT-pS305-q420中csgD的mRNA水平无显著差异。 6.生物信息学预测发现在S.Typhi中存在多种S305的潜在靶基因，功能分析显示这些基因涉及细菌代谢，物质合成等多方面；qRT-PCR验证结果显示基因mtgA和glpT在WT-pS305中的表达水平明显低于WT-pBAD。 结论： 本研究发现S305是一个由阻遏蛋白编码基因cI的3'UTR衍生的sRNA，全长为495nt并与cI序列有部分重叠。S305在S.Typhi野生株的各生长时期表达水平不同，在对数中期和平台期表达丰度较高，在迟缓期和对数晚期表达丰度较低；S305高表达可抑制S.Typhi生物膜形成、动力及生长速率；S305的高表达通过影响fljB mRNA的稳定性来负调控fljB的表达，S305的高表达同时负调控csgD、mtgA和glpT的表达。
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