摘要
番茄(Solanum lycopersicum)是世界范围内广泛种植的蔬菜作物。随着种植面积的不断增大及耕作方式的改变，番茄病害呈现出日益严重的趋势，严重威胁番茄的生产。番茄颈腐根腐病(Fusarium crown and root rot，FCRR)也被称为番茄冠状根腐病，是由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Radicis-lycopersici，Forl)侵染引起的一种土传病害，可造成番茄严重减产甚至绝收。虽然利用化学或物理手段对土壤进行消毒可在一定程度上缓解FCRR的发生，但很难根除该病，因此选育高抗FCRR品种对保障番茄安全、绿色生产具有重要意义。 前人的研究表明，野生种秘鲁番茄(Solanum peruvianum)对FCRR高抗，该性状由位于第9号染色体上的单显性位点Frl(Fusarium oxysporum f.sp.Radicis-lycopersici Resistance)控制。本研究从抗性材料入手，利用经典遗传学连锁分析结合二代重测序的方法对Frl基因进行了精细定位。 首先，我们从感染FCRR的病株中分离了Forl致病菌。为了便于后续研究Forl侵染番茄的过程，我们对Forl进行了遗传改造，获得了分别携带绿色荧光(eGFP)标记和红色荧光(mCherry)标记的病原菌。同时我们对现有Forl人工接种体系进行了优化。将番茄幼苗的接菌时间从3～4叶期提前到1叶期，并将培养湿度由60～70％提高到90％，极大缩短了发病周期。 其次，我们完成了对Frl基因的精细定位。全基因组SNP(Polymorphic single-nucleotide polymorphism)和InDel(Insertion and deletion)分析表明Frl基因是以大片段的形式渗入到栽培番茄中的，其渗入片段大小约为61.2Mb，约占第9号染色体的79％。利用实验室收集的FCRR抗感种质资源及构建的感病材料P1与抗病材料P2的F2代作图群体，我们将Frl定位在分子标记M2和M3之间。该定位区间约为50kb，包含7个候选基因，我们将其命名为Frl-C1～7(Frl Candidate1～7)。序列分析结果表明这7个基因高度同源，并以基因簇形式存在，编码同一类蛋白。通过对这7个基因的克隆和序列比对，我们发现这些基因的CDS序列在抗感材料间均存在一个或多个单碱基差异，造成编码氨基酸发生改变。RT-qPCR结果表明，在7个候选基因中，Frl-C1，Frl-C2，Frl-C3，Frl-C4和Fr l-C7受Forl侵染诱导表达，而且无论是在接种前还是接种后，这5个基因在抗病材料中的表达水平均显著高于感病材料，暗示它们在番茄对Forl的抗性反应中发挥重要作用。 最后，我们还根据抗感材料在Frl定位区间内的序列差异，开发了一个CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)分子标记M2-5。该分子标记对纯合抗感材料、商品杂交种以及F2子代的基因型鉴定结果与表型鉴定结果完全一致，表明该分子标记可以用于Frl基因的辅助选择，并应用到高抗FCRR品种的选育。 综上所述，本研究分离了FCRR致病菌Forl，并建立了完善的人工接种体系。在此基础上，我们将Frl精细定位在50kb的区间内。该区间包含7个候选基因，它们以基因簇形式存在，其中5个受Forl侵染显著诱导表达，推测它们参与调控番茄对Forl的抗性反应。此外，我们还获得了带有荧光标记的Forl菌株，并开发了一个与Frl紧密连锁的分子标记。这些工作为Frl的精细定位、抗病机理研究及育种应用奠定了坚实的基础。
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