摘要
人源胞嘧啶脱氨基化酶APOBEC3G在人体先天免疫系统中对外源逆转录病毒及内源性逆转录因子具有重要抑制作用，能够参与逆转录病毒，如HIV-1（人类免疫缺陷病毒，human immunodeficiency virus1）的衣壳化包装过程并对病毒DNA负链进行C→U的脱氨基化，从而引发DNA降解或在DNA正链上引入G→A突变，使逆转录病毒无法正常复制。HIV-1发展出Vif（病毒感染因子，viral infectivity factor）对APOBEC3G蛋白进行拮抗，Vif能够结合APOBEC3G并招募E3泛素连接酶复合物介导APOBEC3G泛素化后经蛋白酶体途径降解，帮助HIV-1顺利复制。APOBEC3G由两个锌离子结合的结构域CD1和CD2组成，其中N端结构域APOBEC3G-CD1在结合RNA及单链DNA、参与病毒颗粒与细胞融合过程中具有重要功能，且能够被Vif识别并结合，发生泛素化降解，并无脱氨基化催化活性。C端结构域APOBEC3G-CD2具有催化活性，能够识别单链DNA中的5'-CCC-3'片段，对靠近3'端的两个胞嘧啶进行脱氨基化。目前APOBEC3G-CD2的自由态结构已通过核磁及晶体手段得到解析，其与单链DNA的复合物晶体结构也已见报道，但APOBEC3G催化DNA进行双胞嘧啶脱氨基化，特别是对底物DNA序列中间胞嘧啶的脱氨基化机制尚不明确。 论文第一部分，基于上述两个立足点，我们在DNA5'-ATT3C4C5C61AATT-3'中引入位阻较大的碘原子，减慢了APOBEC3G-CD2对ssDNA脱氨基化催化速率，此时APOBEC3G-CD2识别DNA的序列偏好性由5'-CCC-3'转为5'-TCC-3'。通过实时监测的二维13C，15N-过滤TOCSY谱，我们观察到了APOBEC3G-CD2识别CCC片段与TCC片段的两种结合模式，分别生成产物DNA TCUU61与TCUC61，并利用核磁共振(NMR)技术解析了APOBEC3G-CD2与DNATCUU61，TCUC61的复合物溶液结构A3G-PrA，A3G-PrB。其中A3G-PrA体现了识别CCC片段的结合模式，有利于dC6的脱氨基化，DNA以弯折构象结合于蛋白表面沟槽中;而A3G-PrB中的DNA则以直线型模式与A3G-CD2相结合，反映了识别TCC片段的结合模式，能够帮助dC5进行脱氨基化。A3G-PrA与A3G-PrB的复合物结构也表明，与产物DNA存在相互作用的APOBEC3G-CD2表面残基N244，R256，D370，R374等，经前人实验证明都对DNA的结合与酶活具有重要作用，进一步验证了两个复合物结构显示的APOBEC3G-CD2与DNA的两种结合模式的合理性。 论文第二部分，由于Vif能够介导APOBEC3G经泛素化途径降解以帮助HIV-1顺利完成复制，因此Vif与APOBEC3G之间的相互作用是抗HIV-1的重要靶标之一，筛选并得到靶向这两者相互作用的小分子抑制剂对于是抗HIV-1药物的发展具有重要的推动作用。以此为目标，我们开展了以下两个方面的工作:(1)自Vif与泛素连接酶骨架蛋白nCUL5，底物适配蛋白ELOB，ELOC以及CBF-β（核心结合因子β亚基）的五元复合物晶体结构完成解析以来，Vif与APOBEC3G的复合物结构现今尚未见报道，导致以APOBEC3G-Vif相互作用为靶标的小分子抑制剂筛选缺少结构指导。因此，我们对全长APOBEC3G与Vif,CBF-β，ELOB，ELOC，nCUL5形成稳定复合物的组装条件进行了摸索，最终得到了状态较为均一的复合物A3G-Vif-CBF-β-ELOB-ELOC，进行了负染样品的制备与电镜照片的拍摄，为后续通过电镜手段解析该复合物结构并进行以APOBEC3G-Vif相互作用为靶标的抗HIV-1小分子药物设计奠定了基础。(2)为了寻找含有新型骨架的靶向APOBEC3G-Vif相互作用的小分子抑制剂，我们运用表面等离子体共振方法和基于细胞荧光强度的实验方法对一系列含有氨甲酰磺胺键和二硫键为桥键的小分子进行了筛选，发现小分子ZXM1-1与APOBEC3G-CD1和Vif都存在较强结合，并且能够在Vif共表达的条件下恢复细胞内APOBEC3G的表达水平。基于SPR的竞争性结合实验表明ZXM1-1在体外能够有效抑制Vif与APOBEC3G的结合，推动了对该类骨架的小分子抑制剂抗HIV-1活性的进一步研究。
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