摘要
背景及目的： 转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）在正常组织细胞中表达较低，而在肿瘤细胞表面表达增加，是肿瘤细胞相对特异性的分子标志。文献报道及本课题组前期研究证明，肿瘤细胞表面的TfR分子与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10～100倍，在迅速扩增的肿瘤细胞表面高表达，其表达水平与肿瘤的分期和预后相关。TfR以其胞外段结合特性、内吞性和与肿瘤细胞作用特点，作为肿瘤靶向显像诊断与靶向治疗的一个重要特异性标志备受关注。然而，在肿瘤的靶向生物治疗中，如何获得特异性靶向效应细胞的抗体是有待解决的关键问题。本课题旨在前期构建抗TfR-scFv和双价表达载体的基础上，进一步设计并通过DNA重组技术，构建并表达抗人TfR和CD3的双特异性抗体（TfR-BiTE），探索其作用效应及其机制，为其应用于靶向抗肿瘤研究奠定基础。 方法： 1．基因扩增与双特异性抗体表达载体的构建 以pET-28a-CD3-scFv载体为模板，设计引物，通过分子生物学的方法，从模板上获得目的片段NheI-signal-CD3-scFv-BamHI。通过酶切，连接反应，将目的基因片段插入到pOptiVEC-TfR-scFv-His载体TfR-scFv序列与His标签序列之间，构建Single-TfR-CD3-His双特异性抗体真核表达载体。 2．TfR-BiTE载体转染、抗体表达与鉴定 （1）TfR-BiTE载体转染：通过核转染的方式，将线性化的质粒稳定转染到DHFR-/-的DG44细胞中。应用无血清培养基进行选择培养，待细胞正常扩增后使用甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）进行压力筛选，获得阳性稳定表达细胞。运用流式细胞术（FCM）检测细胞培养上清与TfR+肿瘤细胞和CD3+淋巴细胞结合能力，筛选出能够分泌双特异性抗体的多克隆细胞株。最后通过有限稀释和流式鉴定挑选阳性单克隆细胞株； （2）TfR-BiTE抗体的表达：收集稳定表达TfR-BiTE的细胞培养上清，通过镍金属凝胶预装柱，纯化获得TfR-BiTE抗体； （3）TfR-BiTE抗体的鉴定：采用流式细胞术检测TfR-BiTE分别与TfR+肿瘤细胞（HepG2）和CD3+T细胞（PBMCs）的结合。Westernblot检测TfR-BiTE的相对分子量。通过共聚焦显微镜观察TfR-BiTE连接效应细胞和肿瘤细胞。 3．TfR-BiTE对PBMCs的刺激作用 将未刺激的PBMCs进行CFSE染色后与TfR+肿瘤细胞（HepG2或HT1080）和TfR-BiTE共培养24h（或48h）。采用流式细胞术分别检测TfR-BiTE刺激后的PBMCs（效应T细胞）的活化（CD69+GrB+）与增殖（CFSE的平均荧光强度）。运用流式细胞因子检测技术检测共培养上清中，Th1/Th2细胞因子的分泌水平。 4．TfR-BiTE体外抗瘤效应 CFSE标记的未刺激的PBMCs与TfR+肿瘤细胞（HepG2/HT1080/HepG2.215/Molt4）和TfR-BiTE共培养24h（或48h）。采用流式细胞术检测肿瘤细胞的杀伤效应（CFSE?7-AAD+）。 5．TfR-BiTE体内抗瘤效应 NCG小鼠，第0天皮下接种Luc-HepG2细胞，第7天注射新鲜分离的PBMCs，6h后以20μg/mouse的剂量注射TfR-BiTE，连续7天，期间持续监测小鼠肿瘤体积和体重变化。当小鼠肿瘤体积接近2000mm3时，终止实验，并进行小鼠生物发光活体成像。分离肿瘤并拍照，用IHC分析肿瘤组织中T细胞的浸润，评估TfR-BiTE抗瘤作用效果，并用H&E染色方法分析肝脏组织和肾脏组织的损伤情况。 结果： 1．基因的获取及表达载体的构建 以本课题组前期构建的抗TfR-scFv和CD3-scFv相关载体为模板，通过基因工程方法获得TfR-scF和CD3-scFv，并将两者通过不同的方式连接，构建了三种不同结构的双特异性抗体真核表达载体。经克隆/酶切和测序鉴定证明Single-TfR-CD3-His和Single-CD3-TfR-His和Double-Diabody真核表达载体构建成功。 2．TfR-BiT的表达与活性鉴定 （1）瞬时表达与鉴定：通过瞬时转染293T细胞，获取培养上清，分别与HepG2细胞和PBMCs细胞孵育，鉴定三种结构的双特异性抗体结合活性，其中Single-TfR-CD3-His较好，其次是Double-Diabody，最后是Single-CD3-TfR-His。并且，在介导效应细胞PBMCs杀伤肿瘤细胞HepG2中，两种单链式结构Single-TfR-CD3-His和Single-CD3-TfR-His双特异性抗体比双链式结构Double-Diabody的效果好。 （2）稳定表达与鉴定：将两种单链结构式的双特异性抗体，Single-CD3-TfR-His和Single-TfR-CD3-His表达载体分别线性化，转染真核细胞DG44。应用无血清培养基甲氨喋呤（methotrexate，MTX）压力筛选出稳定表达细胞株。稳定转染的细胞培养上清能够很好地与表达TfR的HepG2细胞和表达CD3的T细胞结合，与单抗相似，且Single-TfR-CD3-His的结合比Single-CD3-TfR-His更好。 3．TfR-BiTE刺激PBMC的活化、增殖及其细胞因子的分泌 （1）TfR-BiTE活化T细胞依赖于TfR+肿瘤细胞：当没有靶细胞存在的情况下，TfR-BiTE可以活化T细胞，高表达早期活化标记CD69分子，但是杀伤活性标记GrB的表达仅有约25%。结果表明，在TfR+肿瘤细胞存在的情况下，TfR-BiTE能使CD3+T细胞活化为具有杀伤功能细胞（CD69+GrB+），且CD8+T细胞的活化比CD4+T细胞更为显著。 （2）TfR-BiTE通过TfR+肿瘤细胞促进T细胞增殖：当TfR+的肿瘤细胞存在时，T细胞亚群的CFSE的平均荧光强度明显降低，且在0.1~1000ng/ml浓度范围内，浓度越高，平均荧光强度降低越明显。结果提示，TfR-BiTE能够通过TfR+的肿瘤细胞诱导T细胞的增殖，且在0.1~1000ng/ml浓度范围内，浓度越高，增殖越明显。此外，CD8+T细胞的增殖比CD4+T细胞明显。 4．TfR-BiTE介导PBMCs对TfR+肿瘤细胞杀伤的特性 （1）TfR分子表达依赖性：在共培养体系中，随着TfR-BiTE浓度的升高，TfR+的肿瘤细胞Luc-HepG2细胞死亡不断增加。然而，在TfR—的MX-1肿瘤细胞中基本没有死亡。结果提示，TfR-BiTE在介导PBMCs杀伤肿瘤细胞时，具有TfR表达的依赖性。 （2）TfR分子特异性：在共培养体系中，额外添加了高浓度的TfR mAb或者高浓度的可溶性重组蛋白TfR后，TfR-BiTE对肿瘤细胞的杀伤明显受抑制。结果提示，高浓度的TfR mAb可以与TfR-BiTE竞争性结合肿瘤细胞表面的TfR，从而抑制TfR-BiTE介导的杀伤肿瘤细胞的作用。相同地，高浓度的可溶性重组TfR蛋白可以中和部分的TfR-BiTE，使其有效浓度降低，从而降低了对肿瘤细胞的杀伤。 5．体内TfR-BiTE对肿瘤的抑制作用 NCG小鼠皮下接种Luc-HepG2细胞，第7天注射PBMCs和TfR-BiTE，连续7天注射TfR-BiTE，当小鼠肿瘤体积接近2000mm3时，终止实验。小鼠的肿瘤体积显示，注射了TfR-BiTE组的NCG小鼠肿瘤体积明显小于对照组。进一步肿瘤免疫组织化学（IHC）分析结果显示，TfR-BiTE组的肿瘤组织中，有明显的CD3+淋巴细胞浸润，而对照度没有观察到浸润的淋巴细胞。同时，各实验组小鼠的体重没有差异，小鼠肝组织和肾组织的H&E染色结果也未观察到明显的损伤。以上结果提示TfR-BiTE可以募集T细胞到肿瘤局部，发挥抗肿瘤作用，并且没有肝脏和肾脏的明显损伤作用。 结论： 本课题实验结果表明：①成功构建新型抗TfR×CD3双特异性抗体TfR-BiTE真核表达载体，并实现了在真核细胞中稳定表达；②TfR-BiTE能够分别与TfR+肿瘤细胞和CD3+淋巴细胞结合，介导两者的连接，为肿瘤细胞杀伤提供理论基础；③在TfR+细胞存在的条件下，TfR-BiTE能促进CD3+T细胞活化和增殖，且CD8+T细胞的活化和增殖均比CD4+T细胞更为显著；④与CD3mAb相比，TfR-BiTE活化T细胞表现出更高的Granzyme B的表达和细胞因子的表达能力，其中，IL-2和TNF表达量显著增加；⑤TfR-BiTE能够介导CD3+T细胞杀伤TfR+的肿瘤细胞，且具有TfR表达的依赖性、特异性和丰度相关性的特征。同时，在0.1ng/ml~1000ng/ml的浓度范围内，杀伤效应具有TfR-BiTE浓度依赖性；⑥在Luc-HepG2肿瘤细胞异种移植动物模型中，TfR-BiTE可以募集CD3+T细胞到肿瘤组织，抑制肿瘤的生长，并且没有观察到代谢器官肝脏和肾脏有明显损伤。综上结果表明，本课题所构建的TfR-BiTE为其应用于靶向抗肿瘤研究奠定了良好的基础。
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