摘要
胃癌（GC）是一种发病率非常高的消化系统恶性肿瘤。根据世界卫生组织（WHO）发布的2018年全球癌症数据报告显示，胃癌在全球新发病率排名第六，死亡率排名第二；而在我国，胃癌的发病率和死亡率分别排名为第二和第三位。由于胃癌早期症状不明显，大多数患者一经发现疾病已经发展至中晚期，治疗效果不容乐观，亟需寻找新的治疗药物。研究发现，一些天然产物及其活性成分可以通过抑制细胞周期，诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，同时具有很多优点，如多靶点，疗效好，副作用小。因此，从天然产物中筛选具有抗肿瘤作用的有效单体成分受到越来越多的关注并逐渐被临床认可。吉马酮（Germacrone）是从中药莪术中提取的单环倍半萜类化合物，具有重要的生物作用及生理活性，近年来，其抗肿瘤作用逐渐被人们发现。目前的研究发现肝癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等癌细胞对吉马酮的作用较为敏感，并且吉马酮主要通过诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡而发挥作用。但是吉马酮对胃癌细胞的抑制作用及其机制尚不明确，这也是本研究的主要内容。 目的： 研究吉马酮对胃癌细胞增殖的抑制作用及机制。通过蛋白质组学及生物信息学技术发现吉马酮作用的重要靶蛋白及对细胞周期、凋亡和自噬的影响。 方法： （1）MTT，LDH检测、集落形成，Western Blot检测Ki67的表达以研究吉马酮对胃癌细胞MGC803和SGC7901增殖的影响。 （2）流式细胞术检测吉马酮作用后胃癌细胞周期的变化，Western Blot检测CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin E1的表达。 （3）流式细胞术和Hoechst33258染色检测吉马酮对胃癌细胞凋亡的影响，Western Blot检测Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3和Caspase3表达的变化。 （4）通过透射电镜（TEM）观察吉马酮作用后细胞形态的变化；Western Blot检测自噬相关蛋白LC-3和p62的变化。将吉马酮与20μM氯喹（CQ）联用后，通过MTT和Western Blot研究吉马酮对自噬的影响。 （5）用150μM吉马酮处理胃癌细胞MGC803后，提取细胞总蛋白。通过蛋白质组学技术及生物信息学分析发现吉马酮作用的靶蛋白-HBXIP。 （6）通过质粒构建胃癌细胞内HBXIP蛋白过表达模型。研究HBXIP在吉马酮对胃癌细胞周期、凋亡和自噬影响中所发挥的作用。 结果： （1）吉马酮在50-300μM的浓度范围内以剂量依赖型方式抑制胃癌细胞MGC803和SGC7901增殖。 （2）150μM吉马酮可以显著下调胃癌细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin E1的表达，并诱导胃癌细胞出现G0/G1期阻滞。 （3）吉马酮作用后胃癌细胞凋亡现象明显，Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase3/Caspase3比值增加。 （4）通过TEM，发现吉马酮作用的胃癌细胞中出现自噬小体积聚，LC-3-ii/LC-3-i比值增高，p62表达也明显上调。与CQ联用后，细胞活力明显降低，LC-3-ii/LC-3-i比值与p62表达上调更为显著。以上实验结果表明，吉马酮可以阻滞细胞的自噬进程。 （5）通过蛋白质组学技术，共鉴定出596个差异蛋白，与DMSO组相比，吉马酮组中有350个蛋白表达下调，246个蛋白表达上调。根据生物信息学分析筛选出4个与细胞周期，凋亡及自噬过程均相关的蛋白。其中HBXIP的表达差异最为显著（吉马酮：DMSO=0.455：1）,选择吉马酮进行下一步研究。 （6）过表达HBXIP后，吉马酮对于胃癌细胞的增殖抑制作用被延缓。并且，发现过表达HBXIP能够减弱吉马酮对胃癌细胞周期、凋亡和自噬的影响。 结论： 本研究主要发现吉马酮以剂量依赖型方式抑制胃癌细胞增殖。通过进一步研究发现，吉马酮能够诱导胃癌细胞出现G0/G1期阻滞，诱导凋亡，阻滞自噬进程而发挥抗肿瘤作用。通过蛋白质组学及生物信息学分析发现HBXIP是介导吉马酮发挥以上作用的一个重要靶蛋白。根据胃癌患者的癌旁及癌组织，HBXIP在癌旁组织中呈弱阳性表达，而癌组织中表达显著增强。我们的研究结果表明，吉马酮通过调控HBXIP介导的细胞周期、凋亡及自噬进程抑制胃癌细胞SGC7901和MGC803细胞增殖。
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