摘要
BROTHER OF FT AND TFL1(BFT)被称为FLOWERING LOCUS T(FT)和TERMINAL FLOWER1(TFL1)的兄弟，在植物开花通路中发挥着重要的调控作用。在盐胁迫下，拟南芥BFT蛋白在顶端分生组织中同bZIP转录因子FD互作，形成复合物调控开花转变。实验室前期构建了新陆早33叶组织的酵母双杂cDNA文库，并从中筛选出一个与陆地棉开花促进因子GhFT1蛋白互作的天冬氨酸类似蛋白(Aspartic proteinases,APs)，该蛋白酶基因在植物生长发育、抗病及逆境胁迫过程中起着重要作用。 目的：全基因组鉴定棉花BFT和GhAPs基因，通过生物信息学分析，初步预测GhAPs可能存在的生物学功能；利用蛋白互作和转基因拟南芥研究，探索GhBFT在开花调控中的功能。 方法：基于最近更新的棉花基因组数据库，鉴定棉花BFT和GhAPs基因；RT-PCR技术克隆GhBFT1和GhBFT2基因；实时荧光定量PCR技术检测GhBFT1和GhBFT2基因表达特征；酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)和双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescent complimentary assay,BiFC)技术共同探究GhBFT蛋白与陆地棉FD蛋白之间的相互作用；构建植物表达载体35S:GhBFT1，采用农杆菌介导的花滴法转化野生型拟南芥。 结果：1、棉花BFT基因的全基因组分析：(1)棉花数据库中共鉴定了12个BFT同源基因，其中四倍体陆地棉和海岛棉中均发现了4个BFT基因，二倍体亚洲棉和雷蒙德氏棉中各有2个BFT基因；(2)棉花BFT基因均由4个外显子和3个内含子组成，且1号和4号外显子相对较大；BFT蛋白间理化性质相似性较高，且具有相同的保守基序和保守结构域(D-P-D-x-P;G-x-H-R)；(3)克隆的GhBFT1和GhBFT2基因均来自于D亚基因组，其ORF长度分别为525bp和522bp；(4)GhBFT1和GhBFT2基因均在陆地棉叶中表达量最高，花中次之，且GhBFT1在各组织中表达量显著高于GhBFT2；(5)GhBFT1和GhBFT2不同程度地响应盐、干旱、ABA及高低温胁迫，并具有相似的表达特征；(6)Y2H和BiFC实验证明GhBFT1和GhBFT2均能与陆地棉GhFD1、GhFD2、GhFD3和GhFD4蛋白互作；(7)35S:GhBFT1过表达拟南芥，导致其开花延迟，莲座叶数目增加。 2、棉花APs基因的全基因组分析：(1)陆地棉中共鉴定了87个GhAPs基因，其中83个拥有两个完整的ASP保守位点；(2)系统进化树将其聚类为典型(Typical)(A)、类珠型(Nucellin-like)(B)和非典型(Atypical)(C)三大类，各亚组成员在基因结构、保守基序及氨基酸序列间存在一定的差异；(3)染色体定位显示GhAPs基因在除A04外的所有染色体上均有分布，且发现5对串联重复基因；(4)共线性分析发现，GhAPs基因间存在大量的共线性，且每个GhAPs基因与1~4个基因间存在共线性关系；(5)启动子顺式作用元件预测显示，GhAPs基因启动子含有光、激素(ABA、GA、IBA和MeJA)、逆境胁迫(干旱、低温、抗氧化、防御和应激性)、昼夜节律、分生组织表达、胚乳表达和细胞周期调控等相关元件；(6)组织表达分析结果表明，GhAPs在陆地棉的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、萼片、苞片、花托、花药和花丝及不同发育时期的胚珠和纤维中均不同程度表达。 结论：1、棉花基因组中共含有12个BFT基因，陆地棉和海岛棉中均含有4个，亚洲棉和雷蒙德氏棉中各有2个；GhBFT1和GhBFT2在叶和花中表达量较高，响应盐、干旱、ABA及高低温胁迫；GhBFT1和GhBFT2与陆地棉中4个FD同源蛋白互作；拟南芥中异位过表达GhBFT1，导致转基因拟南芥延迟开花，表明GhBFT可能与FT竞争结合FD蛋白，从而抑制开花转变。 2、陆地棉中共鉴定了87个可能的GhAPs基因家族成员，分为A、B和C三大亚组，各亚组成员基因结构、保守基序和氨基酸序列间存在差异性，预示其可能具有功能多样性；GhAPs在进化过程中可能发生了基因复制事件；GhAPs在棉花各组织和发育时期均表达，暗示其可能参与调控陆地棉种子萌发、胚珠发育及花药形成等生长发育阶段；启动子上富含响应干旱、低温、伤口胁迫及ABA、GA和MeJA等激素相关的元件，表明GhAPs在应对多种胁迫过程中发挥重要作用。
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