摘要
甲壳动物缺乏免疫球蛋白，需要依靠天然免疫抵御病原侵袭。血细胞在甲壳动物的免疫防御体系中扮演了重要的角色，螯虾的血细胞可分为颗粒细胞（granulocytes，GC），半颗粒细胞（semi-granulocytes，SGC）和透明细胞（hyalinocytes，HCs）三类亚群，GC与SGC是主要的细胞类型。目前，血细胞的各个类群在宿主免疫系统中承担的功能还不甚明确。 研究不同类群血细胞功能，首先要对不同细胞类群进行分离纯化。本文建立了利用Percoll不连续密度梯度离心分离螯虾血细胞的方法，并对配制分离体系的缓冲液以及分离体系的密度组成进行了优化。结果发现，由20%，65%和100%的Percoll组成的分离体系分离效果最优；经过转速为500×g离心20min之后，可将螯虾血细胞分为SGC与GC两个细胞层，经流式细胞术分析，发现细胞层纯度均在95%以上，死亡细胞比例低于5%，可用于后续的细胞功能分析。 目前认为，GC的颗粒中储存了大量proPO，可通过脱颗粒作用释放入血并参与宿主的免疫防御。SGC中也含有胞质颗粒，然而SGC是否存在脱颗粒现象之前并无研究。本文将分离纯化的SGC与GC分别贴壁培养使其脱颗粒，随后收集培养上清进行SDS-PAGE分析。结果表明，贴壁培养后，GC与SGC均出现了脱颗粒现象，但二者的蛋白释放动力学有所差异。GC与SGC所释放的蛋白种类大致相似；但其中2条蛋白带为GC特有，另2条蛋白带为SGC特有；此外有2条蛋白条带存在含量差异。对这些差异条带的鉴定工作还在进行中。 此外，本文利用本实验室筛选得到的三株毒力差异较大的病毒分离株（高毒株WSSV-CN01,中毒株WSSV-CN02和低毒株WSSV-CN03）对红螯螯虾进行感染实验，通过对比SGC与GC对不同毒力病毒的响应，探究不同血细胞类群在免疫中的功能。结果表明，WSSV在感染后期均诱导了血细胞凋亡，导致循环血细胞数量（Total hemocyte count，THC）急剧下降。进入循环的WSSV主要由SGC吞噬，而本研究发现SGC对WSSV更为敏感，其数量下降速度远高于GC，从而导致螯虾血细胞类群比例发生显著改变。三株病毒株引起的红螯螯虾循环血细胞数量与组成的变化趋势类似，高毒株与中毒株引起的红螯螯虾血细胞免疫变化的差异显著高于低毒株。而三株毒株在红螯螯虾体内拥有相似的增殖动力学曲线，说明上述差异与病毒增殖速度无关。 以上研究的结果有助于我们认识螯虾不同血细胞类群在免疫系统中承担的功能，并为后续探究螯虾的免疫防御机制及病害防治方法打下基础。
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