摘要
目的：探讨赭曲霉毒素A（OTA）诱导人肾小管上皮（HK-2）细胞凋亡的过程；齐墩果酸（OA）拮抗OTA诱导HK-2细胞凋亡的作用；以及（肿瘤坏死因子相关受体1）TRAP1在OA拮抗OTA诱导HK-2细胞凋亡信号传导的机制。 方法：1.本实验以人肾小管上皮（HK-2）细胞为实验模型，用不同浓度OTA处理细胞24h后，使用CCK-8方法测定细胞存活率，确定OTA的工作浓度。设置对照组（C组，0μmol/L OTA处理24h）、低剂量组（L组，0.2μmol/L OTA处理24h）、中剂量组（M组，1μmol/L OTA处理24h）和高剂量组（H组，5μmol/L OTA处理24h）。使用OTA处理细胞所需时间后，用Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率，同时用Western blot方法测定凋亡相关蛋白TRAP1、Lonp1、CYPD、Cyt-C、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表达。 2.用不同浓度OA预处理细胞2h后，使用CCK-8方法测定细胞存活率，确定OA的工作浓度。设置对照组（CK组，0μmol/L OTA处理24h）、OTA组（OT组，5μmol/L OTA处理24h）、OA对照组（OA组，2μmol/L OA预处理2h）、先OA后OTA组（OO组，2μmol/LOA预处理2h后5μmol/L OTA处理24h）。使用OA和OTA处理细胞至所需时间后，采用CCK-8方法测定细胞存活率，Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率，Western blot方法测定凋亡相关蛋白TRAP1、Lonp1、CYPD、Cyt-C、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、GRP78和CHOP的表达。 3.用TRAP1siRNA瞬时转染细胞5h后，使用Western blot方法测定TRAP1siRNA对TRAP1的抑制效率。设置对照组（CK组，0μmol/L OTA处理24h）、OTA组（OT组，5μmol/L OTA处理24h）、OA对照组（OA组，2μmol/L OA预处理2h）、先OA后OTA组（OO组，2μmol/LOA预处理2h后5μmol/L OTA处理24h）、转染后对照组（CK+组，TRAP1siRNA转染5h后，0μmol/LOTA处理24h）、转染后OTA组（OT+组，TRAP1siRNA转染5h后，5μmol/LOTA处理24h）、转染后OA对照组（OA+组，TRAP1siRNA转染5h后，2μmol/L OA处理2h）、转染后先OA后OTA组（OO+组，TRAP1siRNA转染5h，2μmol/L OA预处理2h后5μmol/LOTA处理24h）。使用TRAP1siRNA、OA和OTA处理细胞至所需要时间后，采用Western blot方法测定凋亡相关蛋白CYPD、Bcl-2、Bax、GRP78和CHOP的表达。 结果：1.随着OTA浓度的增加，细胞存活率随之降低。与C组相比，L组细胞凋亡率略微增加（P＞0.05），而M组和H组细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。L组、M组和H组凋亡相关蛋白TRAP1、Lonp1、CYPD、Cyt-C、Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表达逐渐增加，Bcl-2的表达逐渐降低，尤其是H组相关蛋白的改变具有显著差异（P＜0.05）。 2.2μmol/LOA预处理2h能够显著提高细胞存活率（P＜0.05）。与OT组相比，OO组能够显著降低细胞凋亡率（P＜0.05）。除此之外，与OT组相比，OO组的凋亡相关蛋白TRAP1、Lonp1、CYPD、Cyt-C、Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、GRP78和CHOP的表达显著减少（P＜0.05），而Bcl-2的表达显著增加（P＜0.05）。 3.TRAP1siRNA能够显著抑制TRAP1的表达（P＜0.05）。使用TRAP1siRNA瞬时转染5h后，与CK组、OT组、OA组和OO组分别相比，CK+组、OT+组、OA+组和OO+组凋亡相关蛋白CYPD、Bax、GRP78和CHOP的表达显著增加（P＜0.05），而Bcl-2的表达显著降低（P＜0.05）。 结论:1.OTA可以引起HK-2细胞活力降低，并导致线粒体途径和内质网应激途径细胞凋亡的激活。 2.OA可以拮抗OTA诱导的HK-2细胞活力降低，以及抑制OTA诱导的HK-2细胞线粒体途径和内质网应激途径细胞凋亡的激活。 3.在OA拮抗OTA诱导HK-2细胞凋亡过程中，TRAP1抑制线粒体途径和内质网应激途径细胞凋亡相关信号传导。
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