摘要
乳酸链球菌素（nisin）具有稳定、安全和抑菌的特性，是公认的安全无毒的食品添加剂。乳酸乳球菌F44是nisin的生产菌株，在nisin发酵生产过程中乳酸乳球菌产生大量乳酸，使其发酵液pH值不断降低，这种酸性条件不利于菌株的生长，进而降低nisin的产量。课题组前期研究表明，对乳酸乳球菌细胞壁肽聚糖的适当修饰可提高菌株酸耐受能力，进而提高nisin产量。细胞壁是细胞抵抗外界压力的第一屏障，而D-氨基酸与肽聚糖的生物合成密切相关。本文通过酸耐受和nisin效价分析了19种D-氨基酸对乳酸乳球菌F44的影响。通过万古霉素荧光标记法和液相-质谱法对细胞壁肽聚糖组成进行了分析，并利用分子生物学手段构建了过表达细胞壁合成相关基因murF和ddl的菌株，探究了D-氨基酸与乳酸乳球菌细胞壁合成之间的相互关系。 酸耐受性检测结果和nisin效价分析表明，培养基中添加D-Met，D-Phe，D-Asn等D-氨基酸的菌株存活率和nisin产量均有显著提高，并且通过nisin效价检测排除了D-氨基酸转化为L-氨基酸参与代谢的可能性。Nisin高产菌G-02的实验数据进一步说明D-氨基酸的添加确实可以提高nisin产量。 万古霉素荧光衍生物（Van-FL）标记乳酸乳球菌，荧光强度对比分析结果发现，培养基中添加D-Met或D-Phe的菌株荧光强度较弱，表明D-Met或D-Phe可能结合在细胞壁肽聚糖第4位或第5位。液相-质谱（LC-MS）检测结果表明，细胞壁肽聚糖成分二糖四肽和二糖五肽中均含有D-Met或D-Phe，验证了荧光标记的推测。 过表达murF和ddl基因的结果表明，MurF和Ddl蛋白的过表达，提高了D-Met和D-Phe参与细胞壁合成的概率。而且过表达MurF和Ddl的重组菌株在含D-Met和D-Phe的培养基中表现出良好的耐酸性和较高的nisin产量，其中较明显的是耐性条件菌株存活率提高3倍，nisin产量达到4384.17IU/mL，比原始菌株提高64.57%。在高产菌G-02中过表达murF基因，并同时添加D-Met和D-Phe混合氨基酸，可使nisin产量提高到12000IU/mL左右，为目前文献报道的最高产量。 本研究结果表明，通过D-氨基酸的添加和细胞壁合成相关基因的过量表达可以提升菌株的酸耐受性和nisin产量，为构建高产nisin菌株提供了新思路。
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