摘要
表面活性素是一类包含两个酸性氨基酸残基(谷氨酸和天冬氨酸),五个非极性氨基酸残基(缬氨酸和亮氨酸)和C12-C19β-羟基脂肪酸链的环状脂肽类抗生素。由于其卓越的表面活性和抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性，有望在石油开采、医药等许多工业领域得到广泛应用。但是，野生型枯草芽孢杆菌的表面活性素产量很低，无法满足工业应用的需求。研究表明，提高脂肪酸前体的供应，可以提高表面活性素的产量。但是氨基酸作为表面活性素合成的一种重要前体，其代谢调控与表面活性素合成之间的关系，尚未明确。 在本课题中，我们选择了遗传信息清晰，但是不具有表面活性素生产能力的模式菌株枯草芽孢杆菌168作为底盘细胞。首先，将完整的具有活性的sfp基因表达盒整合到枯草芽孢杆菌168基因组的ydeO基因位点，得到工程菌株BS168NU-S，将其在不加木糖诱导剂的发酵培养基中培养24h后，表面活性素的产量为0.45g/L。然后，利用CRISPRi技术对20个与表面活性素合成相关的四种氨基酸代谢旁路基因的表达进行扰动。将dCas9蛋白的表达盒整合到工程菌株BS168NU-S的基因组上，得到工程菌株BS168NU-Sd。因为dCas9蛋白的高度表达的毒性，对表面活性素的合成产生了消极作用，所以将其在含有4g/L的木糖诱导剂的发酵培养基中培养24h后，表面活性素的产量仅为0.17g/L。以BS168NU-Sd为对照，在20个单基因抑制的工程菌株中，有16个工程菌株的表面活性素产量有效提高。尤其是抑制yrpC、racE或murC的工程菌株，表面活性素的产量明显提高，分别达到0.54g/L、0.41g/L和0.42g/L。这些基因与L-谷氨酸代谢相关，其酰化是表面活性素缩合的第一步。值得一提的是，抑制与L-亮氨酸和L-缬氨酸代谢相关的bkdAA和bkdAB，不仅提高了表面活性素的产量，而且使C14亚型的比例从25.7%(BS168NU-S)和18.7%(BS168NU-Sd)分别提高到82.4%和85.1%。然后，我们对在单基因抑制的情况下，提高表面活性素产量最明显的三个基因yrpC、racE和murC进行组合抑制。在获得的4个多基因抑制菌株中，同时抑制2个基因的3株工程菌的表面活性素产量均有所提高，其中同时抑制yrpC和racE的工程菌株的表面活性素产量最高，达到0.75g/L,达到对照菌株4.4倍以上。 本研究首次通过调控氨基酸代谢来提高枯草杆菌表面活性素的产量，为研究枯草杆菌表面活性素的合成提供了一个新的思路。
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