大肠杆菌产甲羟戊酸的代谢工程研究

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中文摘要：甲羟戊酸（Mevalonic acid，MVA）是一种具有旋光性的有机酸，是合成类异戊二烯等重要前体化合物，在食品、医药、化工行业等有重要应用价值。生物体内乙酰辅酶A是甲羟戊酸的前体物，对甲羟戊酸的合成起重要作用。本研究基于拓展的大肠杆菌代谢网络模型模拟高得率合成乙酰辅酶A的代谢途径，分析并筛选最优途径。构建基于高得率合成乙酰辅酶A最优途径合成甲羟戊酸的大肠杆菌工程菌，进一步通过代谢工程提高甲羟戊酸的合成能力。高得率合成乙酰辅酶A代谢途径的模拟设计。利用引入了来源于KEGG数据库中的498个异源反应的大肠杆菌复合代谢网络模型，基于通量平衡分析（FBA）模拟利用葡萄糖生产乙酰辅酶A的最优合成途径，得到了葡萄糖生成乙酰辅酶A的理论碳摩尔得率超过90%的6条新途径。进一步结合酶和KEGG等数据库的相关信息和文献报道，发现非氧化酵解途径（Non-oxidative glycolysis，NOG途径）可行性最高。甲羟戊酸途径的构建与优化。构建了以T7启动子诱导型表达甲羟戊酸合成的关键酶基因mvaE、mvaS的质粒pCDF-mvaES，将其转入Escherichia coli BL21菌株，构建甲羟戊酸合成菌株B01。通过优化发酵时的诱导剂IPTG的浓度，甲羟戊酸产量达到324.30mg/L。 NOG途径的构建与优化。构建了以trc启动子组成型表达NOG途径关键酶基因fxpk的质粒pBHR70，将其转入甲羟戊酸合成菌株B01，构建NOG途径工程菌株B02。进一步利用不同强度的启动子调节NOG途径的表达强度，以J23104为启动子的质粒pBHR76所表达的NOG途径强度最高，对甲羟戊酸产量的提升作用最为明显，工程菌B06甲羟戊酸产量达到447.80mg/L，相对于B01菌株产量提高了38.08%。非氧化戊糖磷酸途径关键酶基因的过表达。通过向工程菌株B06染色体中插入强启动子J23119过表达非氧化戊糖磷酸途径中的转酮醇酶和转醛醇酶基因talA-tktB，得到工程菌株B08，相对于B01菌株产量提高了56.49%，甲羟戊酸产量最终达到507.49mg/L。本研究中描述的系统代谢工程策略同样也适用于在大肠杆菌中合成其他以乙酰辅酶A为前体物的产品。

作者：

陈露

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关键词：

大肠杆菌甲羟戊酸乙酰辅酶A 代谢网络模型非氧化酵解途径

授予学位：

硕士

学科专业：

生物工程

导师：

王智文、马红武

学位年度：

2019

学位授予单位：

天津大学

语种：

中文

中图分类号：