摘要
目的： 骨关节炎（osteoarthritis，OA）是目前临床上最普遍、最常见的关节退行性疾病，常常受累于膝关节和髋关节。OA可能是由于各种因素引发的全关节性疾病，其中关节软骨和软骨下骨的变化尤为明显和重要。随着基因调控检测技术的应用增加以及软骨组织工程的应用，本研究主要采用人脂肪干细胞诱导成软骨分化，探索特异性miRNA调控脂肪干细胞成软骨分化的作用机制及其调控的信号通路，为临床治疗骨关节炎等疾病中软骨组织工程提供依据。 方法： 分离人脂肪源性干细胞，利用微团法培养脂肪干细胞成软骨分化，探究在脂肪干细胞成软骨分化中特异性表达的蛋白和miRNA。分别预测了miR-1307-3p的靶基因，探究miR-1307-3p在脂肪干细胞成软骨分化中的调节机制和靶基因BMPR2介导的成软骨分化的信号通路激活。此外，我们在本研究中通过生物信息软件Targetscan、miRDB和Starbase等预测miR-23a-3p的靶基因及与其相关的lncRNA，探究了miR-23a-3p在脂肪干细胞成软骨分化中的调控机制。具体研究方法如下： 1.分离人脂肪源性干细胞 脂肪组织由天津海河医院提供，采用胰蛋白酶消化，传代培养后，采用倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞术检测脂肪干细胞表明标志物CD29、CD44、CD45及CD49，鉴定脂肪干细胞是否分离成功。 2.微团法培养诱导脂肪干细胞成软骨分化 本实验中分为两组，对照组和诱导组，对照组中给予基础培养基，诱导组中添加无血清DMEM/F12、5ng/mL FGF-2、10ng/mL TGFβ1、50μg/mL Vc和10-7mol/L地塞米松诱导脂肪干细胞成软骨分化。其余条件相同，分别培养21d后，采用阿尔新蓝染色鉴定软骨分化，免疫细胞化学染色检测细胞中ColII的表达水平，进一步鉴定脂肪干细胞成软骨分化。 3.采用Western blot和qRT-PCR检测细胞中的特异性分子蛋白和mRNA的表达水平。 4.生物信息软件Targetscan、miRDB和Starbase预测miR-23a-3p，miR-1307-3p的靶基因及与其相关的lncRNA，通过双荧光素酶报告系统验证靶基因；并利用qRT-PCR和Western blot检测慢病毒感染细胞后靶基因的表达来验证miR-1307-3p和miR-23a-3p在脂肪干细胞成软骨分化的调控作用。 5.本实验中所有实验数据采用均数±标准差表示，利用SPSS21.0统计软件处理，采用独立样本t检验进行两组间比较，采用单因素方差分析（ANOVA法）进行多组比较，以组间P＜0.05认为具有统计学意义。 结果： 1.分离并鉴定人脂肪源性干细胞成功分离出人脂肪源性干细胞，细胞培养24h呈短小的梭型或多角形。流式细胞术结果显示，ADSCs中CD29、CD44、CD49为阳性表达，CD45为阴性表达。ADSCs有间充质干细胞共同的表面标记物，表明所分离纯化的ADSCs提纯率高，分离ADSCs成功。 2.人脂肪干细胞成软骨细胞分化的鉴定和对照组比较，诱导培养21d后，阿尔新蓝染色明显。免疫细胞化学染色结果显示，诱导组中ColII表达水平显著高于对照组。这些结果表明，微团法成功诱导ADSCs成软骨分化。 3.预测并验证miR-1307-3p的靶基因在线预测miR-1307-3p的靶基因，找到与成软骨分化相关的靶基因BMPR2。双荧光素酶报告实验证实，BMPR2是miR-1307-3p的直接靶基因。过表达miR-1307-3p后，细胞内BMPR2mRNA及蛋白水平都显著降低（P＜0.05）。以上结果证实了miR-1307-3p在hADSCs成软骨分化中直接靶向BMPR2并负调控其表达。 4.miR-1307-3p调控脂肪干细胞成软骨分化过表达miR-1307-3p可明显抑制软骨基质蛋白多糖的沉积，而降低miR-1307-3p的表达可促进软骨基质蛋白多糖的沉积。此外，过表达miR-1307-3p的细胞中COL2A1、SOX9和Aggrecan蛋白和mRNA水平均明显低于对照组，而降低miR-1307-3p的表达后，则有相反的结果。这些结果表明，miR-1307-3p抑制脂肪干细胞成软骨细胞的分化。 5.miR-1307-3p调控脂肪干细胞成软骨分化的信号通路过表达miR-1307-3p时，p-Smad1、p-Smad5和p-Smad8的表达量明显降低；降低miR-1307-3p表达后，则有相反的结果；同时干扰miR-1307-3p和BMPR2后，p-Smad1、p-Smad5、p-Smad8的表达量与单独干扰miR-1307-3p组相比显著减少。这些结果表明，miR-1307-3p直接靶向BMPR2调控Smad1/5/8信号通路影响脂肪干细胞成软骨分化。 6.miR-23a-3p影响脂肪干细胞成软骨分化过表达miR-23a-3p时，软骨基质蛋白多糖的沉积被抑制，而降低miR-23a-3p表达时，软骨基质蛋白多糖的沉积被促进。此外，过表达miR-23a-3p的细胞中COL2A1、SOX9和Aggrecan蛋白和mRNA水平均明显下降，而降低miR-23a-3p表达后则有相反的结果。这些结果表明，miR-23a-3p抑制脂肪干细胞成软骨细胞的分化。 7.LncRNA SNHG5可与miR-23a-3p直接作用在线预测与miR-23a-3p直接作用的lncRNA，找到与成软骨分化相关的lncRNA SNHG5。双荧光素酶报告基因实验证实，lncRNA SNHG5可与miR-23a-3p直接作用。 8.LncRNA-SNHG5逆转miR-23a-3p对hADSC细胞成软骨分化的影响过表达SNHG5可明显增加软骨基质蛋白多糖的沉积，干扰SNHG5表达后，软骨基质蛋白多糖的沉积明显减少。此外，与miR-23a-3p mimics组相比，miR-23a-3p mimics+pcDNA3.1-SNHG5组软骨分化标志物的mRNA和蛋白水平显著升高。 9.miR-23a-3p在软骨形成分化过程中对SOX6/SOX5的影响在线预测miR-23a-3p的靶基因，找到与成软骨分化相关的靶基因SOX6/SOX5。双荧光素酶报告实验证实，SOX6/SOX5是miR-23a-3p的直接靶基因。与对照相比，miR-23a-3p mimics组SOX6/SOX5mRNA和蛋白水平均明显下降，而miR-23a-3p inhibitor组在SOX6/SOX5mRNA和蛋白水平均升高。此外，过表达SNHG5增加了SOX6/SOX5的表达水平，而干扰SNHG5的表达有相反的结果。同时，抑制SOX6/SOX5的表达可降低SNHG5介导的Aggrecan、SOX9和COL2A1的表达水平。 10.SNHG5/miR-23a-3p/SOX6/SOX5调控JNK/MAPK/ERK通路结果显示，pcDNA3.1-SNHG5组中p-JNK、p-p38MAPK、p-ERK的表达明显增加。此外，过表达miR-23a-3p逆转了的SNHG5对JNK/MAPK/ERK通路的影响，而过表达SOX6/SOX5后可进一步逆转。这些结果表明，SNHG5可通过抑制miR-23a-3p，进而正调控SOX6/SOX5的表达并激活JNK/MAPK/ERK通路，从而在hADSCs成软骨化中发挥促进作用。 结论： 1.在hADSCs的体外机制研究表明，miR-1307-3p与BMPR2之间存在调控关系，miR-1307-3p可以直接介导BMPR2，调节Smad1/5/8信号通路抑制脂肪干细胞成软骨分化形成。 2.在hADSCs的体外机制研究表明，SNHG5与miR-23a-3p、miR-23a-3p与SOX6/SOX5之间存在调控关系，SNHG5作为ceRNA可以通过直接调控miR-23a-3p来调控SOX6/SOX5的表达，进而调控下游与软骨分化相关分子的表达和相关功能的实现。
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