摘要
细小病毒是一类单链线性DNA病毒，基因组长约4-6kb，病毒粒子呈无包膜正二十面体。这类病毒通常感染胎儿或新生宿主，引起致死性或病理性感染;对成年宿主则呈现无临床症状或持续性感染。2013年8月，湖北野生动物救护中心有大量孔雀出现精神萎靡并严重腹泻等症状，其中近10只孔雀在一周内死亡。本研究对导致这次孔雀死亡的病原进行了鉴定分析，发现了新的孔雀细小病毒，并对其开展了分子生物学、流行病学等研究。 首先，为了快速有效的检测可能的致病病原，对一只死亡孔雀的组织进行了454宏基因组测序分析，发现了两株新的细小病毒:Peafowl parvovirus1(PePV1)和PePV2，其基因组分别长为4428bp和4348bp，在核酸水平上具有63.95％的一致性，均编码非结构蛋白NS1(50％氨基酸一致性)、NS2(63％)和结构蛋白VP(53％)。基于NS1的进化分析发现，PePV1和PePV2属于细小病毒亚科中新提议的Chapparvovirus属。同时，将PePV1近全长基因组克隆至可复制载体并转染HEK-293T细胞，运用RACE、RT-PCR和Northern blot等方法揭示了其mRNAs编辑方式。结果显示PePV1以一个启动子起始转录，并利用2个多聚腺苷酸位点来终止转录，其中通过一个供体位点和两个受体位点分别剪接形成NS2和VP相应的mRNAs. 由于Chapparvovirus属的VP蛋白与其它属细小病毒的VP不具有同源性，且目前尚没有任何生物学相关研究，首先通过杆状病毒/昆虫细胞表达系统对PePV1的结构蛋白VP1和VP2进行了表达及纯化。结果表明，表达结构蛋白VP2能形成少量的病毒样颗粒。其次，对VP蛋白进行了多克隆抗体及单克隆抗体的制备，并对所获得的单克隆抗体进行了抗原表位筛选，获得了识别两种不同抗原表位的单克隆抗体。 此外，为了进一步确认PePV与孔雀疾病之间的关系，通过PCR检测和免疫组织化学分析方法，对PePV在死亡孔雀组织中的分布进行了检测。PCR检测发现PePV1核酸在死亡孔雀组织心、肝、肺、肠中均存在，并在肝组织中含量最高。免疫组化分析在这四种组织内均能检测到PePV1的结构蛋白VP1。病理切片显示该死亡孔雀的组织呈现出肠炎、肺炎和病毒血症等症状。上述结果表明PePV1感染了该孔雀的多种组织，可能是造成孔雀多器官病变和死亡的主要病因。同时，通过PCR检测对PePV进行了流行病学调查，结果显示PePV在湖北野生动物救护中心的新生孔雀中持续存在，随着孔雀的生长被逐步清除，在连续2年的检测中，每年10月份PePV的检出率最高;此外，在武汉周边部分孔雀饲养基地也检测到PePV1的存在。 综上所述，发现了一种可导致孔雀死亡的新型细小病毒PePV，对其基因组转录图谱、病理及流行病学等方面开展了深入研究，为认识尚浅的Chapparvovirus属细小病毒提供了更多的认知;我们的研究提示，PePV可对孔雀养殖业造成潜在威胁，有必要对其进行长期监测和防控研究，本研究中所表达的结构蛋白及制备的抗体，为今后PePV的检测、预防提供了有效工具。
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