摘要
背景：肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率均居前列，严重威胁着人们的健康与生命。研究发现，DNA基因异常改变致体细胞突变，在肝癌发生发展过程中发挥重要作用。由于肝癌发生部位隐匿，难以早期发现和诊断。因此，大多数患者确诊时已属中晚期，而错过最佳手术治疗时期。化疗是目前治疗中晚期肝癌的主要措施，顺铂是一种临床上广泛使用的化疗药物，然而顺铂大剂量使用可引起严重的副反应，既能杀死正常细胞，又能引起继发性癌症。因此，降低顺铂耐药已成为一项亟待解决的问题。 微小RNAs(miRNAs)属于一类小的、内源性的非编码单链RNAs，一般包含约22个核苷酸。越来越多的证据显示，miRNAs通过与基因的3'-未翻译区(3'-UTR)配对结合，促进mRNA降解或者抑制翻译过程，从而在转录后水平抑制基因表达。近年，大量研究表明，miRNAs参与许多生物学过程，包括细胞增殖、细胞分化、胚胎发育和细胞凋亡、自噬等。值得注意的是，miRNAs失调几乎与所有人类肿瘤的发生、发展密切相关，通过调控基因的表达发挥致癌作用或者抑癌作用。然而，miRNAs在化疗中的作用尚未完全阐明。探讨miR-193b增敏顺铂杀伤肝癌细胞及相关分子机制，对肝癌的临床治疗具有重要意义。 目的：miR-193b是一种多效性的miRNA，具有广谱的抗癌作用，但其对肝癌顺铂化疗致敏性中的作用尚不清楚。本实验选取肝癌细胞HepG2为研究对象，探讨miR-193bmimic转染HepG2细胞后，HepG2细胞对顺铂化疗敏感性的影响及其分子机制，为临床化疗降低肿瘤耐药、提高化疗敏感性提供实验依据和理论基础。 方法：收集南华大学第一附属医院自2011年5月至2014年3月，被诊断为原发性肝癌40例患者在接受肝肿瘤切除手术后的肿瘤组织及癌旁非肿瘤组织标本。培养正常肝细胞系L-02细胞以及肝癌Huh7、HepG2和PLC细胞系，本研究首先通过荧光实时定量PCR(qRT-PCR)法在40对肝癌和癌旁肝组织以及L-02和多种肝癌细胞系中比较miR-193b表达，然后分析miR-193b表达与肝癌患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化、转移、静脉侵犯、卫星灶、肿瘤数量、AJCC分期、甲胎蛋白(AFP)等临床病理参数的关系。最后，将40例肝癌患者分为miR-193b低表达组和miR-19b高表达组，比较两组患者5年生存率。选择处于对数生长期的HepG2细胞，通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度顺铂(1、2、3、4、5和6μM)联合miR-193bmimic处理对肝癌HepG2细胞生存率的影响，同时通过AnnexinV/PI染色法检测顺铂(2μM)联合miR-193bmimic处理对HepG2细胞凋亡率的影响。本研究通过生物信息学软件预测miR-193b潜在的基因髓细胞白血病因子-1(Mcl-1)；qRT-PCR和Westernblot，检测HepG2细胞miR-193b过表达对Mcl-1基因表达的影响；通过荧光素酶报告基因系统，将miR-193bmimic与Mcl-1基因3-UTR野生型及突变型质粒转染HepG2细胞，检测荧光素酶活性；构建pcDNA3.1-Mcl-1载体，检测顺铂联合miR-193bmimic及Mcl-1的siRNA，处理HepG2细胞后细胞生存率的情况；通过MTT和流式细胞检测技术分别检测顺铂(2μM)联合pcDNA3.1-Mcl-1过表达质粒载体(2μg/mL)和miR-193bmimic对HepG2细胞增殖活力和细胞凋亡的影响；采用Westernblot和MTT分别检测顺铂(2μM)联合miR-193bmimic和ZVAD-FMK(10μM)对HepG2细胞caspase-3及其底物多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的表达水平以及细胞存活率的影响。 结果：(1)qRT-PCR结果显示：miR-193b在肝癌组织中的表达水平较相应配对的癌旁组织呈现降低(P＜0.05)，miR-193b在肝癌细胞中的表达水平也较正常肝细胞呈现降低(P＜0.05)，miR-193b的表达与肿瘤分化、转移、静脉侵犯及AJCC分期有关(P＜0.05)，而与性别、年龄、肿瘤大小、卫星灶、肿瘤数量及AFP无明显关系(P＞0.05)，miR-193b低表达组患者5年生存率明显低于miR-19b高表达组患者，差异有显著性(P＜0.01)。(2)MTT检测发现，miR-193b能显著增加顺铂对肝癌细胞的抗增殖作用(P＜0.05)，并呈浓度时间剂量依赖性；此外，流式细胞技术检测发现miR-193bmimic联合顺铂对肝癌细胞的凋亡具有协同作用，即与两者单独使用相比肝癌细胞凋亡的百分率显著增加(P＜0.05)。(3)TargetScan数据库预测分析显示，miR-193b与Mcl-1基因3'-UTR具有结合位点，使用RNAhybrid在线生物信息网站分析发现，miR-193b与Mcl-13′-UTR的结合自由能为-22.5kcal/mol，小于-10kcal/mol，提示Mcl-1可能是miR-193b的潜在调控基因，qRT-PCR和Westernblot检测发现，与NCO对照相比，miR-193bmimic转染组能明显抑制肝癌HepG2细胞中Mcl-1的表达水平(P＜0.05)；荧光素酶报告系统实验结果显示，相比于Mcl-13'-UTR突变型质粒及空白组，miR-193bmimic和野生型质粒共转染入细胞后能明显下调luciferase检测值(P＜0.05)。(4)MTT检测发现miR-193bmimic联合顺铂处理组及Mcl-1siRNA联合顺铂处理组均可引起肝癌HepG2细胞的细胞生存率显著降低(P＜0.05)，qRT-PCR及Westernblot检测发现miR-193bmimic联合pcDNA3.1-Mcl-1过表达质粒载体组能明显提高Mcl-1表达水平，逆转miR-193bmimics引起的Mcl-1表达抑制(P＜0.05)；同时，MTT法和流式细胞检测技术分别检测发现，转染pcDNA3.1-Mcl-1过表达质粒后能够抑制由顺铂联合miR-193bmimic诱导的肝癌HepG2细胞增殖活力下降(P＜0.05)，以及细胞凋亡率(P＜0.05)。(5)MTT法检测发现相比于顺铂联合miR-193bmimic组、ZVAD-FMK与顺铂和miR-193bmimic联用时细胞死亡率明显降低(P＜0.05)，呈药物依赖性，Westernblot显示裂解caspase-3及其底物(PARP)蛋白水平的表达明显增高。 结论：1.肝癌组织和细胞中存在miR-193b低表达，其表达水平与患者预后相关； 2.恢复在HepG2细胞的表达，miR-193b抑制Mcl-1基因表达，细胞生长增殖减慢，凋亡增加，对顺铂的敏感性增强； 3.miR-193b经caspase-3通路，促进细胞凋亡，发挥细胞生长负调控作用。
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