摘要
背景： 肝纤维化是各种病因引起的肝脏损伤后，细胞外基质沉积或瘢痕形成的过程，持续发展会导致肝硬化、乃至肝癌的发生，严重威胁人体健康。由于“肝-肠轴”的存在，肝纤维化时肝脏内异常的代谢反应可以造成肠道稳态的破坏——肠道菌群失调，反之，紊乱的菌群加速肝纤维化的进展。鉴于肝纤维化的可逆特性，明确肝纤维化的发生发展机制并寻找有效的抗肝纤维化手段意义重大。 RhoA是RhoGTP酶超家族的重要成员，与下游靶蛋白ROCK1结合，调节细胞骨架动力学和基因转录等反应，在细胞极化、粘附、运动、入侵、增殖及生存中发挥着重要的作用。新近研究表明，RhoA/ROCK1信号通路参与肝星状细胞的活化，与肝纤维化及肠道损伤有着紧密联系。 当前，临床上并无十分有效的抗肝纤维化药物。传统中药熊果酸(UA)具有保护肝细胞、抑制肝脏炎症及抗纤维化等作用，被认可为抗肝纤维化的潜力药物，但其抗肝纤维化机制以及对肠道菌群的作用尚未明确。本课题组前期实验发现UA可以抑制RhoA/ROCK1信号通路以及保护肠道屏障。基于此，本研究将进一步深入探究UA抗肝纤维化机制以及对肠道菌群的作用。 目的： 明确UA对肝纤维化及肠道菌群的改善作用是否通过调控RhoA/ROCK1信号通路实现。 方法： 1.将健康C57B/L小鼠30只以及利用腺相关病毒(adeno-associated virus， AAV)构建的RhoA表达干预C57B/L小鼠10只，随机分成4组，每组10只，依次为：正常对照组(Control)、肝纤维化模型组(CCl4)、RhoA表达干预组(RhoAi)、熊果酸治疗组(UA)。正常对照组的小鼠给予橄榄油灌胃8周，2ml/kg，每周两次。剩余3组均给予四氯化碳(CCl4)灌胃8周，2ml/kg(橄榄油稀释20％浓度)，每周两次，其中UA组最后四周同时给予UA灌胃(40mg/kg/d)；造模结束后，禁食3天，处死小鼠，获取血、肝脏和粪便标本。 2.HE和Masson染色用于观察肝脏组织病理改变；比色法用于测定肝脏组织中羟脯氨酸含量；双重免疫荧光染色观察肝脏中HSCs活化与肝细胞凋亡情况。 3.通过自动生化分析仪检测小鼠血清中ALT、AST、TBIL含量。 4.利用搭载有shRNA靶向RhoA的腺相关病毒构建出RhoA表达干预小鼠 5.通过免疫印迹法检测肝脏组织中CollagenI、MMP-1、α-SMA、TIMP-1、RhoA、ROCK1在蛋白水平的表达情况。 6.通过实时荧光定量PCR检测肝脏组织中CollagenI、MMP-1、a-SMA、TIMP-1、RhoA、ROCK1在mRNA水平的表达情况。 7.16SrRNA基因高通量测序技术用于检测肠道菌群丰度、多样性及成分的变化情况。 结果： 1.肝纤维化小鼠肝脏中RhoA/ROCK1信号通路的表达情况 1.1肝纤维化小鼠模型验证 HE和Masson染色显示：与Control组相比，CCl4组小鼠肝脏出现损伤、纤维化(P＜0.001)；血清学肝功能指标ALT、AST、TBIL升高(P＜0.05)，提示肝纤维化小鼠模型构建成功，可用于后续实验。 1.2肝纤维化小鼠肝脏中RhoA/ROCK1信号通路的表达情况 在mRNA和蛋白水平，CCl4组小鼠肝脏组织中RhoA/ROCK1信号通路表达均高于Control组(P＜0.001)。 2.RhoA表达干预对肝脏损伤及肝纤维化的影响 2.1RhoA表达干预小鼠模型验证 活体成像显示AAV病毒注射成功；在mRNA和蛋白水平，RhoA表达干预小鼠肝脏中RhoA表达低于Control组(P＜0.05、P＜0.001)，提示RhoA表达干预小鼠模型构建成功，可用于后续实验。 2.2RhoA表达干预对肝纤维化及胶原沉积的影响 相较于CCl4组，RhoAi组小鼠肝脏胶原沉积以及肝纤维化程度出现下降(P＜0.05)。 2.3RhoA表达干预对HSCs活化及肝细胞凋亡的影响 RhoAi组小鼠肝脏中HSCs活化和肝细胞凋亡少于CCl4组(P＜0.001)。 2.4RhoA表达干预对肝功能的影响 与CCl4组相比，RhoAi组小鼠ALT、AST、TBIL均出现升高(P＜0.05)。 2.5RhoA表达干预对肝纤维化相关因子的影响 在mRNA和蛋白水平，RhoAi组小鼠肝脏组织的CollagenI、Timp-1、a-SMA表达低于CCl组，RhoAi组Mmp-1表达则高于CCl组(P＜0.05、P＜0.001)。 3.熊果酸对肝纤维化小鼠肝脏中RhoA/ROCK1信号通路的影响 3.1熊果酸对肝脏损伤及纤维化的影响 与CCl4组相比，UA组小鼠肝脏胶原沉积以及肝纤维程度显著降低(P＜0.05)；HSCs活化及肝细胞凋亡也出现了减少(P＜0.05、P＜0.001)，结果印证了UA的保护肝脏、抗肝纤维化作用。 3.2熊果酸对肝纤维化小鼠肝脏中RhoA/ROCK1信号通路的影响 在mRNA水平，相较于CCl4组，UA组小鼠肝脏组织中RhoA/ROCK1信号通路表达显著降低(P＜0.001)；与之相似，在蛋白水平，UA组小鼠肝脏组织中RhoA/ROCK1信号通路表达也出现了下降(P＜0.001)。 4.肝纤维小鼠肠道菌群的变化情况 4.1肝纤维化小鼠肠道菌群多样性的变化情况 与Control组相比，CCl4组小鼠肠道菌群的α-多样性出现下降(P＜0.05、P＜0.001)。 4.2肝纤维化小鼠肠道菌群结构的变化情况 OTU分析显示了CCl4组和Control组小鼠肠道菌群序列分配存在差异；β-多样性分析提示CCl4组和Control组小鼠的肠道菌群分属于不同群落。 4.3肝纤维化小鼠肠道菌群组成的变化情况 在门水平，CCl4组小鼠肠道中潜在有益菌厚壁菌门、拟杆菌门低于Control组(P＜0.05)，而疣微菌门以及放线菌门则出现了下降(P＜0.05)。线性判别分析也显示CCl4组和Control组小鼠肠道菌群组成存在差异。 5.熊果酸对肝纤维化小鼠肠道菌群的影响 5.1熊果酸对肝纤维化小鼠肠道菌群多样性的影响 与CCl4组相比，UA组小鼠肠道菌群的α-多样性出现上升(P＜0.05、P＜0.001)。 5.2熊果酸对肝纤维化小鼠肠道菌群结构的影响 OTU分析显示了UA组和其他各组小鼠肠道菌群序列分配存在差异；β-多样性分析提示UA组和CCl4组小鼠的肠道菌群分属于不同群落。 5.3熊果酸对肝纤维化小鼠肠道菌群组成的影响 在门水平，UA组小鼠肠道中厚壁菌门、拟杆菌门高于CCl4组(P＜0.05)，而疣微菌门则低于CCl4组(P＜0.05)；线性判别分析也显示UA组和CCl4组小鼠肠道菌群的组成存在差异。 6.RhoA表达干预对肝纤维化小鼠肠道菌群的影响 6.1RhoA表达干预对肝纤维化小鼠肠道菌群多样性的影响 与CCl4组相比，RhoAi组小鼠肠道菌群的α-多样性出现上升(P＜0.05、P＜0.001)。 6.2RhoA表达干预对肝纤维化小鼠肠道菌群结构的影响 OTU分析显示了RhoAi组和其他各组小鼠肠道菌群序列分配存在差异；β-多样性分析提示RhoAi组和CCl4组小鼠的肠道菌群分属于不同群落。 6.3RhoA表达干预对肝纤维化小鼠肠道菌群组成的影响 在门水平，RhoAi组小鼠肠道中厚壁菌门、拟杆菌门高于CCl4组(P＜0.05)，而疣微菌门则低于CCl4组(P＜0.05)；线性判别分析也显示RhoAi组和CCl4组小鼠肠道菌群组成存在差异。 结论： 1.UA通过干预RhoA/ROCK1信号通路发挥抗肝纤维化作用。 2.UA可以改善肝纤维化时肠道菌群的紊乱，该作用与其对RhoA/ROCK1信号通路的干预具有一定的相关性。
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