摘要
目的： 本项研究基于表观遗传修饰紊乱与阿尔茨海默病(Alzheimer'SDisease,AD)发病的高度相关性，以细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)DNA甲基化水平降低致使其过度激活进而导致tau蛋白过度磷酸化为切入点，旨在探讨电针对SAMP8小鼠学习记忆能力、神经元及突触超微结构的影响，初步阐明电针防治SAMP8小鼠学习记忆障碍的效应及表观遗传学作用机制，以期为电针干预AD提供科学的实验依据。 方法： 选取SPF级5月龄雄性SAMR1和SAMP8小鼠共72只，体重(13±3)g，适应性喂养一周后，进行Morris水迷宫实验筛选出合格小鼠，随机分为SAMR1正常对照组12只，SAMP8小鼠60只随机分为模型组、假电针组、2Hz电针组、抑制剂组和电针+抑制剂组，每组12只。对照组和模型组不做任何处理，在治疗组治疗的同时，用相同规格的固定台进行抓取和捆绑；电针组选用“百会”、“肾俞”干预，于“百会”向前平刺3~5mm，“肾俞”向后正中线、与皮肤呈45°角斜刺5mm。接上HANS-200A型电针治疗仪，一对导线分别接百会和肾俞穴，左右侧肾俞交替使用，选用连续波，频率2Hz，电流1mA，以穴位局部微颤为佳，留针20min，每日1次，7日为1疗程，疗程间休息1日，治疗4个疗程共31天；假电针组接电针但不通电；抑制剂组和电针+抑制剂组从第四疗程开始连续7天给予DNA甲基转移酶抑制5-aza-2'-deoxycytidine处理(腹腔注射给药0.2mg/kg/天)。各组小鼠干预结束后，行Morris水迷宫实验评价各组小鼠的空间学习记忆能力。水迷宫实验结束后进行新鲜海马组织取材和灌注取材并进行指标检测：应用透射电镜观察海马CAI区神经元形态、突触数目、突触超微结构的变化；应用Western-blot检测各组小鼠海马区tau-5、tau-pS262、tau-pS404、PHF-1、CDK5、p25及DNMT1蛋白表达水平；应用免疫组化法观察CDK5的阳性神经元数目；应用荧光定量PCR检测各组小鼠海马区CDK5mRNA表达水平；应用甲基化特异性PCR检测各组小鼠海马区CDK5DNA启动子区甲基化水平。 结果： 1.电针对SAMP8小鼠学习记忆能力的影响：①各组SAMP8小鼠体征情况观察：正常组毛色亮泽，精神状态好，进食、饮水及对外界刺激反应正常；与正常组相比，模型组小鼠毛色亮泽度稍差，有轻微脱毛和饮食减少，对外界疼痛、声音等刺激反应稍迟钝；与模型组相比，抑制剂组毛色枯黄，脱毛，饮食减少，动作缓慢，对外界刺激反应迟钝，而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠毛色、精神状态及对外界刺激反应优于模型组，且电针+抑制剂组优于抑制剂组，电针组优于假电针组。②各组SAMP8小鼠Morris水迷宫定位航行实验结果：与正常组相比，模型组小鼠平均逃避潜伏期明显延长(P＜0.01)；与模型组相比，电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05)，抑制剂组小鼠平均逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)；与假电针组相比，电针组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05)。③各组SAMP8小鼠Morris水迷宫空间探索实验结果：与正常组比较，模型组小鼠首次跨越平台时间明显延长、跨越平台次数明显减少，原平台象限停留时间缩短(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组小鼠首次跨越平台时间明显延长、跨越平台次数明显减少,原平台象限停留时间缩短(P＜0.05)，而电针组、假电针组小鼠首次跨越平台时间明显缩短、跨越平台次数明显增加，原平台象限停留时间延长(P＜0.01)；与抑制剂组相比，电针+抑制剂组小鼠首次跨越平台时间明显缩短、跨越平台次数明显增加,原平台象限停留时间延长(P＜0.05)。④各组SAMP8小鼠Morris水迷宫空间辨别能力实验结果：与正常组相比，模型组正确反应次数降低(P＜0.01)；与模型组相比，电针组、假电针组正确反应次数增加(P＜0.01)；与抑制剂组相比，电针+抑制剂组小鼠正确反应次数增加(P＜0.05)，但低于电针组(P＜0.05)。 2.电针对SAMP8小鼠海马CAⅠ区的神经元和突触的影响：①各组小鼠海马CAⅠ区神经元超微结构可见：正常组和电针组神经元形态完整，核和膜结构清晰，可见较多数量的细胞器，内质网、线粒体、溶酶体和高尔基体等形态正常；模型组神经元形态不规则，核和膜结构模糊不清，神经元体积缩小，线粒体数目减少、肿胀并伴随线粒体嵴畸形样改变；抑制剂组神经元形态不规则，核和膜结构模糊不清，神经元体积明显缩小，线粒体数目减少，肿胀并伴随线粒体嵴畸形样改变，内质网、溶酶体和高尔基体等形态均改变。假电针组神经元形态较规则，细胞器数目较电针组减少，胞质水肿严重，胞核固缩，内质网、核糖体及线粒体未见明显异常。电针+抑制剂组形态规则，略有模糊，神经元体积有所减小，线粒体数目较正常有减少等。②各组SAMP8小鼠海马CAI区突触数目变化：与正常组相比，模型组单位面积下突触数目减少(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组单位面积下突触数目减少(P＜0.05)，而电针组、假电针组、电针+抑制剂组单位面积下突触数目增加(P＜0.01或P＜0.05)，且假电针组单位面积下突触数目低于电针组(P＜0.05)。③各组SAMP8小鼠海马CAI区突触后致密带厚度、突触间隙宽度定量分析：与正常组相比，模型组海马CAI区突触后致密带厚度降低、突触间隙宽度略微增宽(P＜0.01；P＜0.05)；与模型组相比，抑制剂组海马CAI区突触后致密带厚度降低(P＜0.05)、突触间隙宽度无显著性差异(P＞0.05)，而电针组、假电针组海马CAI区突触后致密带厚度增厚、突触间隙宽度变窄(P＜0.01；P＜0.05)；与抑制剂组相比，电针+抑制剂组海马CAI区突触后致密带厚度增厚、突触间隙宽度略微变窄(P＜0.01；P＜0.05)。 3.电针对SAMP8小鼠海马区Tau-5及磷酸化位点ser262和ser404的表达水平及PHF-1表达水平的影响：①电针对SAMP8小鼠海马区Tau-5蛋白表达水平的影响：与正常组相比，模型组小鼠海马区Tau-5蛋白水平升高(P＜0.05)；与模型组相比，抑制剂组小鼠海马区Tau-5蛋白水平升高(P＜0.05)，而电针组、假电针组下降(P＜0.05)，且假电针组Tau-5蛋白水平下降幅度低于电针组(P＜0.05)。②电针对SAMP8小鼠海马区磷酸化位点ser262和ser404表达水平的影响：与正常组相比，模型组小鼠海马区磷酸化位点ser262、ser404表达水平升高(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组ser404表达水平升高(P＜0.05)，ser262表达水平无显著性差异(P＞0.05)，电针组、假电针组ser262、ser404表达水平下降(P＜0.05)，且假电针组ser262、ser404表达水平下降幅度小于电针组(P＜0.05)；与抑制剂组相比，电针+抑制剂组ser262、ser404表达水平下降(P＜0.01)。③电针对SAMP8小鼠海马区PHF-1表达水平的影响：与正常组相比，模型组小鼠海马区PHF-1表达水平升高(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组PHF-1相对表达水平无显著性差异(P＞0.05)，电针组、假电针组PHF-1相对表达水平下降(P＜0.05)，且假电针组下降程度低于电针组(P＜0.05)；与抑制剂组相比，电针+抑制剂组PHF-1相对表达水平下降(P＜0.01)。 4.电针对SAMP8小鼠海马区P25及CDK5蛋白表达水平的影响:①电针对SAMP8小鼠海马区P25的影响：与正常组相比，模型组小鼠海马区P25表达增加(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组P25表达水平无明显差异(P＞0.05)，而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠海马区P25表达下降(P＜0.01)，且假电针组、电针+抑制剂组下降水平均较电针组低(P＜0.05)。②电针对SAMP8小鼠海马区CDK5蛋白表达水平的影响：免疫组化结果发现，与正常组相比，模型组小鼠海马区CDK5阳性神经元增多(P＜0.05)；与模型组相比，抑制剂组小鼠海马区CDK5阳性神经元增多(P＜0.05)，而电针组、假电针组小鼠海马区CDK5阳性神经元减少(P＜0.01；P＜0.05)；与电针组相比，假电针组小鼠海马区CDK5阳性神经元增多(P＜0.01)。WB结果发现，与正常组相比，模型组小鼠海马区CDK5水平升高(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组小鼠海马区CDK5水平升高(P＜0.05)，而电针组和假电针组降低(P＜0.01；P＜0.05)；与电针组相比，假电针组和电针+抑制剂组小鼠海马区CDK5水平升高(P＜0.05)；与抑制剂组相比，电针+抑制剂组小鼠海马区CDK5水平降低(P＜0.01)。 5.电针对SAMP8小鼠海马区DNA甲基转移酶DNMT1、CDK5DNA启动子区甲基化水平及CDK5mRNA水平的影响:①电针对SAMP8小鼠海马区DNMT1水平的影响：与正常组相比，模型组小鼠海马区DNMT1相对表达水平下降(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组DNMT1相对表达水平略下降(P＜0.05)，而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠海马区DNMT1相对表达水平显著增高(P＜0.01或P＜0.05)；与电针组相比，假电针组小鼠海马区DNMT1相对表达水平增幅略低(P＜0.05)。②电针对SAMP8小鼠海马区CDK5DNA启动子区甲基化水平的影响：与正常组相比，模型组小鼠CDK5DNA启动子区甲基化水平下降(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组小鼠CDK5DNA启动子区甲基化水平下降(P＜0.05)，而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠CDK5DNA启动子区甲基化水平明显升高(P＜0.01或P＜0.05)，且假电针组、电针+抑制剂组小鼠CDK5DNA启动子区甲基化水平均低于电针组(P＜0.05)。③电针对SAMP8小鼠海马区CDK5mRNA水平的影响：通过荧光定量PCR检测发现，与正常组相比，模型组小鼠海马区组织CDK5mRNA水平升高(P＜0.01)；与模型组相比，抑制剂组小鼠海马区组织CDK5mRNA水平升高(P＜0.05)，而电针组、假电针组小鼠海马区组织CDK5mRNA水平下降(P＜0.01；P＜0.05)，且假电针组小鼠海马区组织CDK5mRNA水平较电针组高(P＜0.05)。 结论： 1.电针可改善SAMP8小鼠空间学习记忆能力损伤，通过改善海马区神经元及突触超微结构损伤可能是电针改善SAMP8小鼠学习记忆能力损伤的重要机制之一。 2.电针可通过抑制CDK5的过度激活而抑制tau蛋白过度磷酸化，减少神经原纤维缠结的形成，从而减轻神经元和突触超微结构损伤。 3.电针可通过上调海马区DNMT1的表达，升高CDK5基因启动子区甲基化水平从而抑制CDK5基因的转录和表达，进而抑制tau蛋白过度磷酸化，可能是电针减轻SAMP8小鼠神经元和突触超微结构损伤，改善学习记忆能力损伤的重要机制之一。
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