摘要
背景： 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜炎为主要病理改变的系统性炎症性自身免疫病，全球发病率约为0.5-1.0%。我国大陆地区患病率约为0.42％，总患病人数约500万。目前，我国的RA治疗效果尚不理想，据估计有超过50%的中国RA患者，在诊断后没有经过规范治疗。作为一种常见的致残性疾病，本病的长期治疗及预后不佳，给患者家庭及社会带来沉重的经济负担。因此，迫切需要探求早期诊断、评估病情的生物标志物及有效的治疗靶点。 细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族是特征性SOCS盒胞浆蛋白分子家族。SOCS是细胞因子信号传导的经典抑制剂，由SOCS1-7和CIS等8种成分组成。其中，SOCS1在免疫细胞的调节中发挥重要作用。SOCS1的SH2结构域可直接与激活的Janus激酶(JAKs)环结合，且通过其激酶抑制区域直接抑制JAK酪氨酸激酶活性。并且Janus激酶/信号传导和转录激活因子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription， JAK-STAT)通路是RA发病机制中公认的重要信号通路。因此，SOCS1可能参与了RA的发病过程，针对SOCS1参与的通路进行研究，可能为RA的治疗提供潜在的靶点。 众所周知，编码基因的表达水平受到上游MicroRNA(miRNA)的调控，目前有文献证实miRNA的表达异常和RA的发生发展有着密切的联系，因此探索靶基因相关miRNA是研究靶基因的核心环节。miRNA是真核生物内源基因编码的18-25个核苷酸长单链非编码RNAs。在固有免疫及适应性免疫的信号转导过程中，miRNAs均起着重要的调节作用。目前报道的miRNAs，包括miR-146a、miR-155、miR-223等，可能参与了RA的发生发展过程。有报道显示，相对于骨性关节炎患者，RA外周血来源外周血单核细胞的miR-150-5p在RA患者中高表达。另有报道，注射间充质干细胞来源的miR-150-5p外泌体可降低胶原诱导关节炎小鼠的后脚掌厚度和临床关节炎评分。因而，miR-150-5p亦可能参与了RA的发病过程。 既往研究显示，在系统性红斑狼疮中，miR-150-5p可通过作用于SOCS1，上调促纤维化蛋白，从而促进肾纤维化。说明miR-150-5p与SOCS1存在相互作用。两者的共同作用，是否参与了RA的发生发展，则需进一步明确。在RA患者关节中，RA滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASFs)大量增加，导致滑膜增厚。同时RASFs可导致细胞外基质变性降解，进而侵蚀关节软骨和骨。因而在RA的发病过程中，RASFs是关键细胞之一。基于JAK-STAT通路，通过miR-150-5p靶向调控SOCS1的表达，影响RASFs的生物学功能，从而改善RA的预后，值得研究。 如上所述miR-150-5p/SOCS1在RA中的作用，我们提出miR-150-5p和SOCS1可能作为诊断和评估RA的病情的生物标志物；miR-150-5p通过调控SOCS1的表达，进而影响JAK-STAT通路，从而改变RASFs的凋亡、增殖等生物学效应，最终影响RA的发生发展。为验证假设，本文进行了以下三方面的探索： 第一部分，通过系统评价，探讨RA患者外周血SOCS1mRNA的表达及其与RA的相关性。 第二部分，通过病例对照研究，探索外周血白细胞(peripheral blood leukocyte，PBL)中SOCS1mRNA、miR-150-5p在RA患者中的表达；二者对RA的诊断价值，及其与临床疾病活动度指标、实验室炎症指标的相关性。 第三部分，通过细胞实验，在RASFs细胞系MH7A细胞中，探讨miR-150-5p对SOCS1及JAK-STAT通路的作用，以及对MH7A细胞的生物学效应。 第一部分外周血SOCS1mRNA与RA相关性的系统评价 目的： 系统评价RA患者外周血SOCS1mRNA与RA的相关性 方法： 计算机检索英文数据库：PubMed、Embase、WebofScience、theCochraneLibrary，及中文数据库：中国期刊全文数据库、中文科技期刊数据库、万方数据库、中国生物医学文献数据库。检索时限从建库至2019年10月。手工检索相关杂志，搜集国内外有关外周血来源的SOCS1mRNA与RA相关性的研究，同时追踪纳入文献的参考文献。按照Newcastle-OttawaScale评价纳入文献质量，提取有效数据，用Revman5.3进行Meta分析。用STATA12.0进行敏感性分析及发表偏倚分析。 结果： 共纳入4个研究，其中3个病例对照研究，1个队列研究。共307例样本，其中239例RA样本，68例健康对照者样本。结果显示： (1)与健康对照组比较，RA患者外周血T细胞的SOCS1mRNA明显升高[WMD=1.98，95%CI(1.14，2.83)，P＜0.05]；RA患者外周血单核/巨噬细胞的SOCS1mRNA明显升高(P＜0.05)；RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的SOCS1mRNA无明显升高[WMD=0.47，95%CI(-0.91，1.85)，P＞0.50]。 (2)敏感性分析发现，Ortiz,A.M(2013)队列研究为异质性来源。剔除此项研究后，所有病例对照研究的亚组分析显示，与健康对照组比较，RA患者PBMC的SOCS1mRNA明显升高[WMD=1.10，95%CI(0.51，1.68)，P=0.0002]。 (3)Begg漏斗图(P=0.089)或Egger回归检验(P=0.018)提示，可能存在发表偏倚。 结论： SOCS1与RA可能存在一定的相关性。但结果估算的精确性，可能受样本量较小、发表偏倚等因素的影响。 第二部分RA患者PBL中miR-150-5p、SOCS1mRNA的表达及其临床意义 目的： 探讨RA患者PBL中miR-150-5p、SOCS1mRNA的表达及其与RA临床疾病活动度指标、实验室炎症指标的相关性。 对象和方法： 纳入自2018年5月至2018年12月，就诊于江西中医药大学附属医院风湿病科，符合RA分类标准的患者57例，同期选择19例年龄、性别等相匹配的健康体检者作为健康对照组。 (1 )测定所有受试者的血常规、肝功能、肾功能、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)等一般实验室资料。 (2)采用聚合酶链式反应法(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)测定所有受试者外周血miR-150-5p、SOCS1mRNA的表达水平。 (3)采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定所有受试者的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α,白细胞介素(interleukin，IL)-6，IL-21的相对表达水平。 (4)评估RA患者的疾病活动度：疾病活动性评分(28-joint disease activity score，DAS 28)-ESR、DAS28-CRP、临床疾病活动指数(clinical disease activity index，CDAI)、简化疾病活动指数(simplified disease activity index，SDAI)。 (5)统计分析RA组与健康对照组的miR-150-5p、SOCS1mRNA的表达水平。并分析miR-150-5p、SOCS1mRNA对RA的诊断价值，及其与疾病活动度、实验室指标的相关性。 结果： (1)与健康对照组比较，RA组的miR-150-5p表达水平低，有统计学差异(4.61±0.17vs1.75±0.79，P＜0.05)；而SOCS1mRNA表达水平升高，有统计学差异(9.18±0.38vs18.12±1.57，P＜0.05)； (2)与健康对照组比较，RA组的IL-6表达水平升高，有统计学差异(38.36±7.00vs57.91±32.64，P＜0.05)；而TNF-α、IL-21的表达水平无显著差异(P＞0.05)； (3)通过ROC曲线比较，根据Youden指数，RA患者PBL中miR-150-5p区分RA患者与健康人群的最佳界值为3.06(AUC=0.974，P＜0.05)；SOCS1mRNA无法区分RA患者(AUC=0.425，P＞0.05)； (4)miR-150-5p、SOCS1mRNA的相对表达水平与ESR、CRP、TNF-α、IL-6、IL-21、DAS28-ESR、DAS28-CRP、CDAI、SDAI等指标无明显相关性(P＞0.05)。 结论： RA患者PBL中miR-150-5p低表达，SOCS1mRNA高表达。miR-150-5p可能是区分RA与健康人群的潜在生物标志物。 第三部分miR-150-5p对RASFs生长和SOCS1表达的影响 目的： miR-150-5p参与了免疫疾病的调控和发病，其具体机制尚不明确。本部分着重探讨miR-150-5p对RASFs细胞的生长，及对SOCS1和JAK2-STAT3通路的影响。 方法： (1)设计与合成靶向结合SOCS1基因的miR-150-5pmimics和negativecontrolmimics； (2)培养MH7A细胞，实验随机分为3组：正常对照(Normal control)组、NCmimics组，miR-150-5pmimics组；基于上述分组，miR-150-5p模拟剂(miR-150-5p mimics)、阴性对照模拟剂(negative control mimics，NC mimics)分别转染MH7A细胞。 (3)双荧光素酶法验证miR-150-5p、SOCS1的靶向结合关系； (4)CCK8检测细胞活性；流式细胞学方法检测细胞凋亡及细胞周期；RT-PCR测定miR-150-5p及SOCS1mRNA的表达；WesternBlot蛋白测定SOCS1、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3等蛋白；ELISA测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6的表达水平。 结果： (1)与NCmimics组比较，miR-150-5pmimics组细胞凋亡率降低(28.877±1.241vs19.963±2.264，P＜0.05)和S期细胞比例升高(13.780±6.878vs26.003±1.917，P＜0.05)；RASFs细胞增殖率升高(103.230±11.998vs130.751±22.702，P＜0.05)； (2)双荧光素酶报告基因分析结果显示，与NCmimis组比较，miR-150-5pmimics组的相对荧光强度明显下降，有统计学差异(25.462±1.006vs21.839±0.187，P＜0.05)； (3)与NCmimics组比较，miR-150-5pmimics组SOCS1mRNA的相对表达水平显著降低，有统计学差异(1.2401±0.164vs0.190±0.050，P＜0.05)； (4)与NCmimics组相比，miR-150-5pmimics组SOCS1蛋白的表达水平显著降低，有统计学差异(0.629±0.052vs0.459±0.028，P＜0.05)；miR-150-5pmimics组JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3等蛋白的表达水平无显著差异(P＞0.05)； (5)与NCmimics组比较，miR-150-5pmimics组细胞培养基中的IL-6水平明显升高，有统计学差异(63.294±1.798vs132.570±5.886，P＜0.05)；对TNF-α的表达水平无明显影响(P＞0.05)。 结论：miR-150-5p可促进MH7A细胞的生长及IL-6的分泌，抑制SOCS1mRNA的表达。提示miR-150-5p可能是RA治疗的新靶点。 总之，本文将从荟萃分析研究、临床研究、细胞研究等多层面共同探讨miR-150-5p、SOCS1mRNA在RA患者中的表达水平变化及其对RA的诊断价值和对疾病活动度、疾病严重程度的评估价值，并探索miR-150-5p靶向结合SOCS1对RASFs生物学功能的影响，以期为RA的诊治提供新的理论基础。
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