摘要
脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后，形成髓鞘的少突胶质细胞会大量死亡，导致轴突发生脱髓鞘改变，引起轴突电活动传导受阻，是最终导致机体损伤侧肢体运动、感觉等功能障碍的重要原因之一。如何促进轴突脱髓鞘病变后，髓鞘的再生修复及机体结构与功能的恢复，是目前国内外研究的重点与难点。 个体发育过程中，髓鞘的形成过程较为复杂，涵盖了少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)的迁移、增殖、分化，少突胶质细胞(oligodendrocytes, OLs)的成熟以及完成轴突的髓鞘化等一系列复杂过程。完整的髓鞘结构是维持轴突正常电传导的必要条件，此外，研究还发现，作为轴突信号的一种，神经元电活动对髓鞘发育形成的全过程发挥着至关重要的影响。此外，也有研究发现，在SCI后，增强神经元电活动可以有效地促进OPCs增殖、分化以及OLs成熟，从而提高机体髓鞘再生能力。因此，研究神经元电活动是如何影响中枢神经系统损伤后髓鞘的再生修复过程，可为临床治疗脊髓损伤、多发性硬化等疾病提供临床应用的理论依据。但是，目前我们对于神经元电活动影响髓鞘再生修复的具体过程仍不甚清楚，还有待进一步研究。化学遗传学技术作为一种有价值的科学研究工具，它是利用遗传学原理，通过化学小分子来干扰或者过表达某类物质，从而实现生理过程中对特定蛋白质功能的调节，具有创伤性小、靶向精准调控的特点。特定药物激活特定受体技术(designer receptors executively activated by designer drugs，DREADDs)也归属于化学遗传学技术，它通过与N-氧化氯氮平(CNO)的联合应用，可用于特定时间靶向操控特定神经元的电活动兴奋性，受到了广大神经科学研究学者的喜爱。 小鼠解剖功能定位显示，控制小鼠后肢运动功能的锥体束主要分布在胸10(T10)及以下脊髓后索的皮质脊髓束，这些神经轴突主要起源于躯体运动皮层的第V、VI层锥体神经元。因此，本研究中，在小鼠T10节段轻度脊髓挫裂伤所致的背侧皮质脊髓束(dorsal corticospinal tract, dCST)脱髓鞘病变后，我们通过DREADDs策略控制其大脑初级运动皮层第V层的锥体神经元电活动，探讨了不同水平(激活/正常/抑制)的神经元电活动兴奋性，对dCST髓鞘再生修复过程及小鼠运动功能恢复的影响。 实验方法： 1.轻度脊髓挫裂伤模型的dCST脱髓鞘验证：使用Allen’s打击仪，打击重量为5g，分别设置假手术组，2.5mm×5g组，5mm×5g组，7.5mm×5g组，共4种打击力度致小鼠T10节段的脊髓挫裂伤。伤后利用小鼠BMS试验，评估实验动物脊髓损伤的严重程度；伤后2w，通过EC染色、免疫荧光染色以及电镜检测每组小鼠dCST脱髓鞘情况。 2.首先于成年雄性野生型小鼠初级运动皮质的第Ⅴ层，行病毒的脑立体定位注射(激活型：pAAV-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRES-mCitrine，抑制型：pAAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry)。病毒注射后2w，对所有的动物实施轻度脊髓损伤(2.5mm×5g)。SCI后2w，予以为期4w的每日小鼠腹腔注射，其中实验组注射CNO(激活DREADDs受体)，对照组注射等量生理盐水。腹腔注射结束后对所有实验动物进行灌注取材，通过免疫荧光染色观察少突胶质谱系细胞(OPCs、少突胶质细胞)的变化；使用BMS量表及不规则水平楼梯试验，评价SCI后小鼠后肢运动功能的恢复。 实验结果： 1.小鼠BMS试验：SCI后2w内所检测的时间点，2.5mm×5g组小鼠的评分均明显高于5mm×5g组和7.5mm×5g组(P<0.0001)，且2.5mm×5g组在SCI2w时的评分与假手术组相比没有明显的统计学差异。EC染色：SCI2w后，假手术组小鼠的染色结果在脊髓白质中显示正常；2.5mm×5g组的脊髓后索中包括dCST的染色明显变浅；5mm×5g组中染色变浅范围增大，达到了白质前联合；7.5mm×5g组中染色变浅范围最大，甚至到达了前索，组织结构非常紊乱。GFAP免疫荧光共染：2.5mm×5g打击力度所致的SCI后，星形胶质细胞数量反应性增加，但胶质瘢痕界限范围较小，5mm×5g组中可见胶质瘢痕界限超过脊髓后索甚至延伸到两侧后角灰质，且组织结构紊乱，7.5mm×5g组中胶质瘢痕界限超过灰质前联合，脊髓大部分组织受到严重损坏。透射电镜图：进一步显示2.5mm×5g组中，dCST处大部分轴突保留相对完好，并且存在广泛的髓鞘脱失现象。 2.神经元电活动被激活后，皮质神经元的神经原癌基因蛋白(cFos)表达量增多，而抑制组中cFos表达量减少(P<0.001)。经过4w的神经元电活动调控，检测到激活组的MBP荧光强度明显增高(P<0.001)，而抑制组中MBP荧光强度明显低于其他三组(P<0.001)；处在增殖期的少突胶质前体细胞(Ki67+/PdgfRα+/DAPI+)，激活组明显多于其他三组(P<0.001)，抑制组OPCs数量则少于对照组(P<0.05)；激活组中成熟的少突胶质细胞(APC/CC1+Olig2+/DAPI+)数量多于其他三组(P<0.01)，而抑制组则少于对照组(P<0.05)。行为学结果：小鼠BMS评分在SCI后1d降至最低，后逐渐恢复至伤前水平，但四组间没有出现明显的统计学差异；不规则水平楼梯试验显示，激活神经元电活动2w后，小鼠左侧后肢的错误率低于其他三组(P<0.05)，这种情况持续保持至4w后，小鼠左侧后肢的错误率仍旧明显低于其他三组(P<0.01)。 结论： 1.Allen’s打击仪2.5mm×5g(轻度)的致伤力度，能较好的造成成年小鼠脊髓T10节段的轻度脊髓挫裂伤，使得病灶处dCST发生广泛的脱髓鞘改变而轴突得以保留，符合实验需要。 2.利用化学遗传学策略DREADDs，即脑立体定位注射AAVs联合腹腔注射CNO，能够成功激活或抑制皮层神经元电活动。 3.双向调控神经元电活动兴奋性，能有效操控少突胶质谱系细胞的发育及髓鞘再生，且主要影响少突胶质前体细胞的增殖、少突胶质细胞的成熟过程及轴突的再髓鞘化。 4.提高初级运动皮层神经元电活动兴奋性，能促进轻度脊髓挫裂伤小鼠，后肢技巧性运动功能的恢复；但降低神经元电活动水平对小鼠技巧性运动功能的恢复影响不明显。
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